Étude d'Alzheimer et de la maladie de Parkinson utilisant les fibrilles préformées

insights from industryAriel Louwrier, Ph.D.PresidentStressMarq Biosciences Inc.

Une entrevue avec Ariel Louwrier, Ph.D., discutant le développement des fibrilles préformées pour la recherche dans des troubles neurodegenerative tels qu'Alzheimer et la maladie de Parkinson.

Que connaissons-nous les rôles du Tau et du l'Alpha-Synuclein dans l'esprit humain sain ?

Malheureusement, peu est connu au sujet de ce sujet. Nous savons que le tau est impliqué dans la formation de microtubule, qui permet à une alimentation en marchandises d'atteindre des cellules et de les maintenir en bonne santé. Dans la maladie d'Alzheimer, le tau devient hyper-phosphorylé, entraînant la dégénérescence neurofibrillary et par la suite, mort cellulaire.

Nous connaissons cet alpha-synuclein, une protéine modulaire de monomère, est abondant dans le cerveau. Il existe sous un grand choix de formes comprenant des oligomères, fibrilles, et de plus grands gisements dans les patients souffrant de la maladie de Parkinson ou des systèmes multiples s'atrophient (MSA).

L'Alpha-synuclein s'accumule pour former les fuselages de Lewy ou les neurites de Lewy, qui peuvent être circulaires ou oblongs en structure. Nous croyons que ces fuselages de Lewy sont toxiques et impliqués dans le massacre des neurones dopaminergiques, menant au développement des troubles des mouvements comme la maladie de Parkinson.

De façon générale, ce sont des protéines très compliquées qui peuvent former des multimers les uns avec les autres. Elles dépendent des conditions de phosphorylation et d'autres modifications goujon-de translation, qui peuvent être tout à fait complexes.

Fuselages de Lewy - illustrationCrédit d'image : medistock/Shutterstock.com

Comment les fibrilles préformées actives peuvent-elles être employées pour étudier Alzheimer et la maladie de Parkinson ?

Les fibrilles préformées sont des outils qui permettent à des scientifiques d'imiter les effets pathophysiologiques d'Alzheimer et la maladie de Parkinson dans le cerveau. On l'a présumé que des fibrilles recombinées pourraient être synthétisées et introduites aux cellules pour induire la pathologie de la maladie, permettant à un modèle d'être développé.

Les pathologies peuvent être induites par tau ou alpha-synuclein de sur-expression de manière endogène, ou à l'aide des mutants de tau ou d'alpha-synuclein qui totalisent plus rapidement. Cependant, les animaux transgéniques requis pour ces expériences peuvent prendre un bon moment de mûrir, signifiant que les investigations peuvent être des procédés prolongés. En revanche, l'injection des fibrilles peut induire la pathologie dans seulement 30 jours.

(l) L

(l) L'alpha-synuclein PFFs de souris induisent la pathologie d'alpha-synuclein goujon-injection de 30 jours dans le cerveau de rat. (r) Le mutant humain K18 PFFs de P301L induisent la pathologie de tau goujon-injection de neuf semaines dans le cerveau transgénique de souris de P301L.

Car les fibrilles sont recombinées en nature, ceci produit des opportunités et des défis car ils ne sont pas les reproductions exactes des structures trouvées dans le cerveau. Par exemple, si nous exprimons des fibrilles en Escherichia coli., l'hôte n'a pas les machines moléculaires pour effectuer les modifications de traduction qui, parfois, peuvent être extrêmement importantes et sont une partie inhérente de ces protéines chez l'homme. Réciproquement, le fait que ces différences existent permet la différenciation claire des protéines endogènes et exogènes.

Nous avons prouvé que des fibrilles sont non seulement reprises, par exemple, par les cellules primaires neurocortical, mais pouvons également être transportés dans ces cellules. C'est essentiel pour induire la pathologie liée à Parkinson, qui est trouvé utilisant un phospho-anticorps à un réseau acide aminé particulier à la position 129.

Des fibrilles peuvent être injectées dans la culture cellulaire ou directement dans le cerveau de rongeur ; nous permettant de recenser et mesurer la pathologie, et donnant à scientifiques un modèle pour examiner les candidats neufs de médicament.

LL'alpha-synuclein fluorescent-marqué par ATTO633 PFFs ont été repris, transporté dans le soma, et la totalisation induite d'alpha-synuclein dans des cellules primaires neurocortical de souris. (l) Les neurites ont rempli de graines fluorescent-marquées d'alpha-synuclein dans un système microfluidic de Co-culture après 24 heures. (r) Les graines d'Alpha-synuclein dans le soma et les neurites des cellules primaires neurocortical de souris après 24 heures. Accueil d'expérience et de représentation de Cellectricon.

Queest-ce que d'autres méthodes sont procurables pour induire le neurodegeneration in vivo ? Comment ces méthodes comparent-elles aux fibrilles et aux oligomères préformés ?

Une voie est d'introduire l'alpha-synuclein à des niveaux plus élevés génétiquement. Alternativement, l'alpha-synuclein ou le tau peut être introduit par l'intermédiaire de l'invasion de virus. Par ces mécanismes, vous pouvez également introduire les versions mutées qui sont plus agressives et accélérer le procédé de totalisation.

Nous employons un concept assimilé avec les fibrilles. Par exemple, une des mutations dans la maladie de Parkinson familiale est à la position des acides aminés 53. Nous effectuons les fibrilles de mutant d'A53T, qui sont beaucoup plus agressives dans la totalisation de injection in vitro et in vivo que les fibrilles traditionnelles de type sauvage. L'utilisation des fibrilles est plus rapide et plus sophistiquée que l'overexpression génétique ou les méthodes de vecteur virales.

Notre objectif est d'introduire quelque chose qui est aussi étroitement que possible à ce qui est dans le cerveau. Les cellules nous aident avec ceci. Un organisme de recherche a récent constaté que les fibrilles introduites peuvent être hydrolytiquement traitées - fendu - après avoir présenté les cellules et peuvent subir des modifications de goujon-traduction aussi bien.

Avec un objectif assimilé à l'esprit, nous avons effectué un élément de tau qui est phosphorylé et le goujon-de translation modifié utilisant les cellules F9. Il fibrilizes indépendamment sans admission. Ce produit sera lancé très bientôt. Nous sommes très intéressés de voir sa prise, comment elle est employée, et ce qui sont les résultats.

Les fibrilles tendent à former les structures très spécifiques qui ressemblent aux helices. Elles sont deux entités déformées autour de l'un l'autre, appelé un filament hélicoïdal appareillé, bien que les boucles déformées uniques existent également. Nous avons élevé certains de ces filaments sur les échafaudages linéaires naturels et amovibles.

Anticorps attaquant le neurone mourantCrédit d'image : Design_Cells/Shutterstock.com

Où la compagnie a commencé ? Comment ces produits ont-ils été développés ?

Les efforts concernant le rétablissement des outils pour la recherche neurodegenerative de la maladie ont commencé par une question par Email à partir d'un chercheur sur la Côte Est (Etats-Unis). Il avait été expédié nos petits groupes par un autre universitaire pour qui nous avions effectué quelques autres éléments, dans un endroit qui n'a eu essentiellement rien à faire avec la neurologie.

Le chercheur a voulu voir si nous pourrions effectuer les fibrilles préformées d'alpha-synuclein. En tant que pharmacien de protéine, j'ai pensé que ce serait simple. Il n'y a pas beaucoup de compagnies qui prendront un risque et essayeront des choses sans facturer lui, mais nous sommes l'une d'entre elles.

Nous avons effectué l'élément et l'avons envoyé au chercheur, mais ils sont revenus et ont dit que cela n'a pas fonctionné. Cela nous a pris six ou sept mois pour figurer à l'extérieur que nous avions effectué un type entièrement différent de la fibrille que ce qu'ils avaient attendu. C'était une courbe d'apprentissage énorme pour nous parce que la littérature indique primordialement un type unique de fibrille sur lequel la majeure partie de la recherche est basée.

Nos études ont proposé qu'il y ait au moins deux types de fibrilles, et qu'elles sont très différentes entre eux. Il y a de la littérature pour supporter ceci, mais les chercheurs supposent normalement qu'il y a un type que parfois les travaux et ne fait pas parfois. Cependant, l'objectif des chercheurs n'est généralement pas d'effectuer les outils ou les fibrilles.

Ils sont bien plus intéressés à évaluer des événements en aval une fois que les fibrilles ont été introduites dans un système vivant. Ceci comprendrait essayer de neutraliser le rétablissement de la pathologie utilisant leurs propres candidats de médicament. Cependant, le type de fibrille est critique car vous ne pouvez pas neutraliser une pathologie qui n'a pas été produite en premier lieu !

Nous avons commencé à réaliser qui était non seulement là une opportunité d'un point de vue commercial, mais il y avait également quelque chose scientifiquement importante qu'a été manqué que nous pourrions fournir à la communauté de la recherche. Cela nous a aboutis avalent ce circuit de développement, et depuis lors nous avons effectué à multiple différents types des fibrilles pour différentes applications, ainsi que fournissant les monomères.

Avant tout, il n'y a jamais eu un bon contrôle pour de ce travail. Quand aucune autre fibrille n'est procurable, les gens emploient traditionnellement des monomères. Ceci produit potentiellement une édition, car les monomères veulent auto-nucléé et commencent à fibrilize sur leurs propres moyens, ainsi tandis qu'ils sont bons pour une expérience à court terme, ils peuvent être inappropriés pour une étude à long terme.

Pour résoudre ceci, nous avons développé une méthode pour forcer un cousin très proche d'alpha-synuclein, bêta-synuclein appelé, à fibrilize. C'est un élément totalement inerte et complet artificiel qui n'injecte pas l'alpha-synuclein ou lui-même. C'est la première fois qu'il y a un contrôle fibrillaire procurable pour n'importe quelle industrie. Sur ceci, nous avons préparé des anticorps à ces éléments.

Pourquoi l'avez-vous ressenti étiez-vous important pour ajouter les oligomères dopamine-stabilisés à votre portefeuille ?

Il y a des limitations à l'installation des fibrilles. Bon nombre d'entre elles sont mal comprises parce qu'elles sont insolubles. Les lecteurs principaux dans le domaine, tel que le Michael J. Fox Foundation, qui réalise une fonction incroyable dans l'endroit, affirment en leurs publications que des fibrilles exigent de la sonication de les réduire à une certaine taille (longueur) afin de pour être employées dans les expériences.

La sonication est un procédé violent. Elle comporte la création des microboules qui s'effondrent parmi les températures que nous associerions généralement au centre du soleil - un à deux millions de degrés centigrade. Clairement, les résultats sont qu'il y a énormément de tension oxydante continuant, quelque chose qui n'est pas souvent considérée quand ces fibrilles sont employées.

En outre, ce que nous connaissons l'alpha-synuclein tourne autour des cellules dopamine-produites. Ainsi, nous avons voulu pouvoir examiner « plus tôt » le procédé avant que des fibrilles soient effectuées, quand les monomères composent les oligomères solubles - une forme différente de la protéine totalisée aux fibrilles.

Il y a une opinion générale dans l'industrie que les oligomères sont les substances toxiques. les oligomères Dopamine-stabilisés étaient les premiers à fabriquer et être lancé parce qu'ils sont vraisemblablement plus biologiquement appropriés que d'autres types.

(l) TEM des oligomères Dopamine-Stabilisés d(l) TEM des oligomères Dopamine-Stabilisés d'Alpha-Synuclein (r) TEM du l'Alpha-Synuclein PFFs d'A53T.

Comment les fibrilles préformées devraient-elles être préparées pour l'usage ? Pourquoi la sonication est-elle importante ici ?

Elle dépend de l'élément étant employé. D'une façon générale, les deux méthodes requises pour effectuer des fibrilles sont purification et secousse. Les premiers monomères sont purifiés, et alors l'environnement devient critique, comme ceci détermine ce qui se produit ensuite. Des monomères doivent être secoués pendant des jours, qui accélère le procédé de fibrillization.

Les monomères totalisent pour former des oligomères, oligomères de protofibril, et rallongent éventuel dans des fibrilles.Les monomères totalisent pour former des oligomères, oligomères de protofibril, et rallongent éventuel dans des fibrilles.

Les nuances dans ces méthodes sont très importantes ; par exemple, que l'échafaudage est employé ? Si l'échafaudage ne peut pas être retiré, est-ce que cela introduira un autre facteur et accélérera plus de rétablissement de ce construire particulier en dehors de avec de votre contrôle ?

Comme j'ai cité précédemment - la sonication est souvent considérée en tant qu'étant nécessaire comme méthode qui permet la réduction de taille de fibrille à un niveau où il peut vraisemblablement produire de la pathologie. Nous pensons que c'est probablement des corps étrangers de ce qui est réellement approprié, qui est solubilisation des fibrilles. Ceci se produit pendant la sonication. Une fois que des différences de phase (solubles et insolubles) ont été retirées entre la substance monomérique et fibrillaire, toutes les limitations diffusionnelles liées à ces deux phases sont réduites ou retirées.

Pourquoi est-il important pour les fibrilles préformées choisies d'une substance appropriée ?

Éventuel la plupart des gens veulent travailler avec les éléments humains. Cependant, les gens travaillent dans les rongeurs à une partie. Des rongeurs sont bien caractérisés et il y a beaucoup d'éléments transgéniques procurables.

Elle peut également transformer plus de sens pour que les chercheurs mettent un élément de souris dans une souris plutôt qu'un élément humain en souris. L'expérience éventuelle a juste une variable, et tandis que ce n'est pas toujours possible in vivo, est il ce que les chercheurs essayent de réaliser et ceci leur permet d'être une opération plus près de ce paradigme.

Avoir plus d'un élément à choisir du du pouvoir être très utile parce que quelques versions sont plus agressives. Il y a, par exemple, des éléments d'être humain qui contiennent des mutations pour les effectuer plutôt l'élément de souris, qui est plus agressif qu'un élément humain. Éventuel, les chercheurs veulent généralement déménager le sens qui leur donne des caractéristiques concernant l'état humain.

Nous avons collaboré avec l'HÔTE pour vérifier des éléments d'être humain et de souris chez les souris. Avec les éléments de souris, la pathologie peut être vue non seulement dans le lieu d'injection mais partout dans le cerveau dans tous les cas après 30 jours. C'est important car il prouve que la pathologie peut écarter.

En revanche, cependant, quand vous employez la version humaine, l'injection est moins agressive et ainsi la pathologie se développe à un régime beaucoup plus lent. Après l'injection avec des éléments d'être humain, pathologie se développe dans environ 25 pour cent des rats après 30 jours de comparé à 100 pour cent des rats injectés avec l'élément de souris. Dans quelques applications, le temps est important, et c'est quand l'emploi d'une méthode plus rapide de rétablissement de pathologie peut porter en appel.

Queest-ce qu'autre a préformé des fibrilles et des monomères offrez-vous ?

Nous avons un certain nombre de d'autres fibrilles et monomères comprenant la dismutase (TTR) 1 (SOD1) de transythyretin et de superoxidase. En termes de tau, nous avons également différentes versions et tailles.

Il y a une autre protéine d'intérêt TDP-43 appelé qui est important dans la maladie d'Alzheimer. C'est difficile que nous n'avons pas pu effectuer avec succès encore.

Dans certains cas, la formation des oligomères ou les fibrilles peut entrer dans une multitude de sens, produisant de différents types d'éléments qui ont les propriétés variables, selon des états de synthèse. Normaliser ces méthodes ainsi que la caractérisation d'élément fait partie du défi que nous relevons.

Êtes-vous planification pour augmenter la gamme de produits ? Si oui, que les protéines vous orienteront en circuit ensuite et pourquoi ?

Oui, développer des éléments neufs est un procédé actuel. Nous voulons pouvoir distinguer entre les éléments fibrillaires, par exemple, comme entre les deux types des fibrilles d'alpha-synuclein, ainsi de nous développent des anticorps pour faire cela.

Dans un avenir immédiat, un des principaux efforts va être avec des oligomères. Nous avons lancé les oligomères de dopamine, qui a entraîné la prise la plus rapide de tous les produits nouveaux dans notre histoire.

Nous voulons également effectuer d'autres versions qui sont induites par les composantes matérielles plutôt que des modifications covalentes. De plus, nous voulons effectuer les éléments qui sont plus artificiels et induits par des petites molécules.

Éventuel, nous voulons produire quelque chose qui est aussi stable comme possible que des imitateurs ce qui se produit dans la vie réelle ; au moment où nous ne savons pas ce que l'élément qui est. Ce peut bien être l'option de dopamine, mais la détermination de cela est dans le domaine des chercheurs de maladie de Parkinson. Nous préparerons, introduirons, et fournirons les oligomères variés. Une partie de ceci se fondera sur la collaboration avec d'autres organismes, qui est quelque chose que nous sommes toujours désireux pour faire.

Nous planification pour préparer des anticorps pour tous les éléments afin de les différencier. Au moment où, nous avons un qui semble recenser des oligomères. Nous avons fait plusieurs projets sur ces éléments et avons interviewé des centaines de candidats, mais nous avons seulement un anticorps jusqu'ici. C'est un autre endroit où nous voyons le potentiel.

Les oligomères sont la voie avant et ils ont prouvé à être un effort délicat. Ils doivent être effectués et correctement caractérisés, et n'importe quelle synthèse donnée peut produire de plus d'une population. Peut-être nous pourrons fournir plus d'une population des oligomères bientôt - ce fait partie de notre objectif et engagement au secteur de recherches.

Où peuvent nos lecteurs trouver plus d'informations ?

Au sujet d'Ariel Louwrier, Ph.D.

ArielAriel Louwrier est le Président et Directeur Général de StressMarq Biosciences Inc., une compagnie des sciences de la vie basée dans Victoria, Canada. La compagnie se spécialise dans des produits de recherches pour la recherche neurodegenerative de la maladie. Ariel retient un Ph.D. en biochimies de l'université de Kent (R-U), et est un camarade d'entreprise de l'International de société de tension de cellules.

Kate Anderton

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Kate Anderton

Kate Anderton is a Biomedical Sciences graduate (B.Sc.) from Lancaster University. She manages the editorial content on News-Medical and carries out interviews with world-renowned medical and life sciences researchers. She also interviews innovative industry leaders who are helping to bring the next generation of medical technologies to market.

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