Studio Alzheimer e della malattia del Parkinson facendo uso delle fibrille preformate

insights from industryAriel Louwrier, Ph.D.PresidentStressMarq Biosciences Inc.

Un'intervista con Ariel Louwrier, Ph.D., discutente lo sviluppo delle fibrille preformate per ricerca sui disordini neurodegenerative quali Alzheimer e la malattia del Parkinson.

Che cosa conosciamo circa i ruoli della tau e dell'Alfa-Synuclein nel cervello umano sano?

Purtroppo, piccolo è conosciuto circa questo oggetto. Sappiamo che la tau è compresa nella formazione del microtubulo, che permette che un'offerta delle merci raggiunga le celle e le tenga in buona salute. Nel morbo di Alzheimer, la tau è iper-fosforilata, causando la degenerazione neurofibrillary e successivamente, morte delle cellule.

Conosciamo quell'alfa-synuclein, una proteina della particella elementare del monomero, siamo abbondanti nel cervello. Esiste in vari moduli compreso gli oligomeri, fibrille ed i più grandi depositi in pazienti che soffrono dalla malattia del Parkinson o i sistemi multipli atrofizzano (MSA).

L'Alfa-synuclein si accumula per formare gli organismi di Lewy o i neurites di Lewy, che possono essere circolari o prolungati in struttura. Crediamo che questi organismi di Lewy siano tossici ed implicati nell'uccisione dei neuroni dopaminergici, piombo allo sviluppo dei disordini di movimento come la malattia del Parkinson.

In generale, queste sono proteine molto complicate che possono formare i multimers a vicenda. Dipendono dagli stati di fosforilazione e da altre modifiche post-di traduzione, che possono essere abbastanza complessi.

Organismi di Lewy - illustrazioneCredito di immagine: medistock/Shutterstock.com

Come possono le fibrille preformate attive essere usate per studiare Alzheimer e la malattia del Parkinson?

Le fibrille preformate sono strumenti che permettono che gli scienziati imitino gli effetti patofisiologici di Alzheimer e della malattia del Parkinson nel cervello. È stato supposto che le fibrille recombinanti potrebbero essere sintetizzate e presentate alle celle per indurre la patologia della malattia, permettendo che un modello sia sviluppato.

Le patologie possono essere indotte dalla tau o dall'alfa-synuclein d'espressione in modo endogeno, o usando i mutanti dell'alfa-synuclein o di tau che cumulano più rapido. Tuttavia, gli animali transgenici stati necessari per questi esperimenti possono richiedere molto tempo maturare, significando che le indagini possono essere lunghi trattamenti. Al contrario, iniettare le fibrille può indurre la patologia solo nei 30 giorni.

(l) L

(l) L'alfa-synuclein PFFs del mouse induce la patologia dell'alfa-synuclein un'post-iniezione dai 30 giorni nel cervello del ratto. (r) Il mutante umano K18 PFFs di P301L induce la patologia di tau un'post-iniezione da nove settimane nel cervello transgenico del mouse di P301L.

Poichè le fibrille sono recombinanti in natura, questa genera entrambe le opportunità e sfide poichè non sono repliche esatte delle strutture trovate nel cervello. Per esempio, se esprimiamo le fibrille in Escherichia coli., il host non ha il macchinario molecolare per effettuare le modifiche di traduzione che, in alcuni casi, possono essere estremamente importanti e sono una parte inerente di queste proteine in esseri umani. Per contro, il fatto che queste differenze esistono permette la chiara differenziazione delle proteine endogene ed esogene.

Abbiamo indicato che le fibrille non solo sono prese, per esempio, dalle pile neurocortical, ma possiamo anche essere trasportati all'interno di queste celle. Ciò è essenziale per l'induzione della patologia connessa con Parkinson, che è individuato facendo uso di un phospho-anticorpo ad una catena particolare dell'amminoacido alla posizione 129.

Le fibrille possono essere iniettate in coltura cellulare o direttamente nel cervello del roditore; permettendo che noi identifichiamo e misuriamo la patologia e dando a scienziati un modello per esaminare i nuovi candidati della droga.

LL'alfa-synuclein fluorescente-contrassegnata ATTO633 PFFs è stata presa, trasportato nel soma e nell'aggregazione indotta dell'alfa-synuclein in pile neurocortical del mouse. (l) Neurites ha riempito di semi fluorescente-contrassegnati dell'alfa-synuclein in un sistema microfluidic della co-cultura dopo 24 ore. (r) Semi dell'Alfa-synuclein all'interno del soma e dei neurites delle pile neurocortical del mouse dopo 24 ore. Cortesia di rappresentazione e di esperimento di Cellectricon.

Che cosa altri metodi sono disponibili per l'induzione del neurodegeneration in vivo? Come questi metodi confrontano alle fibrille ed agli oligomeri preformati?

Un modo è di introdurre l'alfa-synuclein ai livelli elevati geneticamente. Alternativamente, l'alfa-synuclein o la tau può essere introdotta via l'invasione del virus. Attraverso quei meccanismi, potete anche introdurre le versioni mutate che sono più aggressive ed accelerare il trattamento dell'aggregazione.

Usiamo un simile concetto con le fibrille. Per esempio, una delle mutazioni nella malattia del Parkinson familiare è alla posizione 53 dell'amminoacido. Rendiamo a A53T le fibrille mutanti, che sono molto più aggressive nell'aggregazione di semina in vitro e in vivo che le fibrille selvaggio tipe tradizionali. L'uso delle fibrille è più veloce e più specializzato della sovraespressione genetica o dei metodi di vettore virali.

Il nostro scopo è di introdurre qualcosa che sia vicino come possibile a che cosa è nel cervello. Le celle ci aiutano con questa. Un gruppo di ricerca recentemente ha trovato che le fibrille presentate possono idrolitico essere elaborate - fenduto - dopo avere entrato nelle celle e possono subire le modifiche di post-traduzione pure.

Con un simile scopo in mente, abbiamo fatto una costruzione di tau che è fosforilata e post--di traduzione modificata facendo uso delle celle F9. Fibrilizes indipendente senza induzione. Questo prodotto sarà lanciato molto presto. Siamo molto interessati vedere il suo assorbimento, come è usato e che cosa i risultati sono.

Le fibrille tendono a formare le strutture molto specifiche che assomigliano alle eliche. Sono due entità torte intorno ad a vicenda, chiamato un filamento elicoidale accoppiato, sebbene i singoli fili intrecciati egualmente esistano. Abbiamo coltivato alcuni di questi filamenti sulle impalcature lineari naturali e smontabili.

Anticorpi che attaccano neurone di morteCredito di immagine: Design_Cells/Shutterstock.com

Dove la società ha cominciato? Come questi prodotti sono stati sviluppati?

Gli sforzi concernenti la generazione di strumenti per la ricerca neurodegenerative di malattia hanno cominciato con un'indagine del email da un ricercatore sulla costa Est (U.S.A.). Era stata trasmessa i nostri dettagli da un altro accademici per cui avevamo reso ad alcune altre costruzioni, in un'area che ha avuta essenzialmente niente a che fare con la neuroscienza.

Il ricercatore ha voluto vedere se potessimo fare le fibrille preformate dell'alfa-synuclein. Come chimico della proteina, ho pensato che questo fosse semplice. Ci non sono molte società che si assumano una responsabilità e provino le cose senza addebitare, ma siamo una di loro.

Abbiamo fatto la costruzione e la abbiamo inviata al ricercatore, ma hanno ritornato e detto che non ha funzionato. Ci ha richiesto sei o sette mesi per capire che avessimo fatto un tipo interamente differente della fibrilla che che cosa stavano prevedendo. Ciò era una curva di apprendimento enorme per noi perché la letteratura in modo schiacciante indica un singolo tipo di fibrilla su cui la maggior parte della ricerca è basata.

I nostri studi hanno suggerito che ci fossero almeno due tipi di fibrille e che sono molto differenti l'uno dall'altro. C'è una certa letteratura per supportare questo, ma i ricercatori suppongono normalmente che c'è un tipo che a volte gli impianti ed a volte non fa. Tuttavia, lo scopo dei ricercatori non è generalmente di fare gli strumenti o le fibrille.

Sono molto più interessati nella valutazione degli eventi a valle una volta che le fibrille sono state presentate in un sistema vivente. Ciò comprenderebbe tentare di neutralizzare la generazione di patologia facendo uso dei loro propri candidati della droga. Tuttavia, il tipo della fibrilla è critico poichè non potete neutralizzare una patologia che non è stata generata in primo luogo!

Abbiamo cominciato a realizzare che non solo era là un'opportunità da una prospettiva commerciale, ma c'era scientifico egualmente qualcosa importante che è stato mancato che potremmo assicurare alla comunità di ricerca. Quello piombo noi si scola questo percorso dello sviluppo e da allora abbiamo reso a multiplo i tipi differenti delle fibrille per le applicazioni differenti come pure fornendo i monomeri.

Per di più, non c' è stato mai un buon controllo per c'è ne di questo lavoro. Quando non c'è nessuna altra fibrilla disponibile, la gente usa tradizionalmente i monomeri. Ciò potenzialmente crea un'emissione, poichè i monomeri vogliono auto-nucleato e cominciano fibrilize da sè, in modo da mentre sono benissimo per un esperimento a breve termine, possono essere inadatti per uno studio a lungo termine.

Per risolvere questo, abbiamo messo a punto un metodo per forzare un cugino molto vicino dell'alfa-synuclein, chiamato beta-synuclein, per fibrilize. È una costruzione completamente inerte e completamente artificiale che non semina l'alfa-synuclein o stessa. Ciò è la prima volta che c'è un controllo fibrillare disponibile per tutta l'industria. Sopra questo, abbiamo preparato gli anticorpi a queste costruzioni.

Perché la avete ritenuta eravate importante da aggiungere gli oligomeri dopamina-stabilizzati al vostro portafoglio?

Ci sono limitazioni all'utilità delle fibrille. Molte di loro sono capite male perché sono insolubili. I giocatori principali nel campo, quale il Michael J. Fox Foundation, che fa un processo incredibile nell'area, asseriscono in loro pubblicazioni che le fibrille richiedono la sonicazione di portarle giù ad una determinata dimensione (lunghezza) per essere utilizzato negli esperimenti.

La sonicazione è un trattamento violento. Comprende la creazione dei microbubbles che sprofondano in mezzo delle temperature che assoceremmo generalmente con il centro degli un - due milione gradi centigrado sole-. Chiaramente, i risultati sono che c'è una somma enorme di sforzo ossidativo che accende, qualcosa che non sia considerato spesso quando queste fibrille sono usate.

Ancora, che cosa conosciamo circa l'alfa-synuclein gira intorno alle celle dopamina-generate. Così, abbiamo voluto potere esaminare “più presto„ il trattamento prima che le fibrille fossero fatte, quando i monomeri compongono gli oligomeri solubili - un modulo differente della proteina cumulata alle fibrille.

C'è una credenza generale nell'industria che gli oligomeri sono le specie tossiche. gli oligomeri Dopamina-stabilizzati erano i primi da essere fabbricati e lanciati perché sono probabilmente più biologicamente pertinenti che altri tipi.

(l) TEM degli oligomeri Dopamina-Stabilizzati dell(l) TEM degli oligomeri Dopamina-Stabilizzati dell'Alfa-Synuclein (r) TEM dell'Alfa-Synuclein PFFs di A53T.

Come dovrebbero le fibrille preformate essere preparate per uso? Perché è la sonicazione importante qui?

Dipende dalla costruzione che è usando. In linea generale, i due metodi stati necessari per fare le fibrille sono depurazione e scuotere. I primi monomeri sono depurati e poi l'ambiente diventa critico, come questo determina che cosa accadrà dopo. I monomeri devono essere scossi per i giorni, che accelera il trattamento di fibrillization.

I monomeri cumulano per formare gli oligomeri, oligomeri del protofibril ed infine allungano nelle fibrille.I monomeri cumulano per formare gli oligomeri, oligomeri del protofibril ed infine allungano nelle fibrille.

Le sfumature in questi metodi sono molto importanti; per esempio, che l'impalcatura sta usanda? Se l'impalcatura non può essere eliminata, quella introdurrà un altro fattore ed accelererà più generazione di quella costruzione particolare fuori del vostro controllo?

Ho citato più presto - la sonicazione è pensata spesso a come essendo necessaria come metodo che permette la riduzione della dimensione della fibrilla ad un livello in cui può probabilmente da generare la patologia. Pensiamo che questo sia probabilmente un artefatto di che cosa è realmente pertinente, che è la solubilità delle fibrille. Ciò si presenta durante la sonicazione. Una volta che le differenze di fase (solubili ed insolubili) sono state eliminate fra le specie monomeriche e fibrillari, tutte le limitazioni diffusionali connesse con quelle due fasi sono diminuite o eliminate.

Perché è importante alle fibrille preformate selezionate dall'specie appropriate?

Infine la maggior parte della gente vuole lavorare con le costruzioni umane. Tuttavia, la gente lavora in roditori in una fase precedente. I roditori sono caratterizzati bene e ci sono molte costruzioni transgeniche disponibili.

Può anche avere più significato affinchè i ricercatori metta una costruzione del mouse in un mouse piuttosto che una costruzione umana in un mouse. L'ultimo esperimento ha appena una variabile e mentre questo non è sempre possibile in vivo, è che cosa i ricercatori stanno provando a raggiungere e questo li permette di essere un punto più vicino a quel paradigma.

Avere più di una costruzione da scegliere dal può da essere molto utile perché alcune versioni sono più aggressive. Ci sono, per esempio, costruzioni dell'essere umano che contengono le mutazioni per farle più simile alla costruzione del mouse, che è più aggressiva di una costruzione umana. Infine, i ricercatori vogliono generalmente muoversi nella direzione che dà loro i dati relativi allo stato umano.

Abbiamo collaborato con l'ASS.COMM. per verificare le costruzioni del mouse e dell'essere umano in mouse. Con le costruzioni del mouse, la patologia può essere veduta non solo nel sito iniezione ma dappertutto nel cervello in tutti i casi dopo i 30 giorni. Ciò è importante poichè indica che la patologia può spargersi.

Al contrario, tuttavia, quando usate la versione umana, la semina è meno aggressiva ed in modo dalla patologia si sviluppa ad una tariffa molto più lenta. Dopo che l'iniezione con le costruzioni dell'essere umano, patologia si sviluppa in circa 25 per cento dei ratti dopo i 30 giorni rispetto a 100 per cento dei ratti iniettati alla costruzione del mouse. In alcune applicazioni, il tempo è importante e questo è quando usando un metodo più rapido di generazione di patologia può fare appello a.

Che cosa altro ha preformato le fibrille e monomeri offrite?

Abbiamo una serie di altri fibrille e monomeri compreso la dismutasi (TTR) 1 (SOD1) di superoxidase e di transythyretin. In termini di tau, egualmente abbiamo le versioni e dimensioni differenti.

C'è un'altra proteina di TDP-43 chiamato interesse che è importante nel morbo di Alzheimer. Quello è difficile che non abbiamo potuti fare con successo ancora.

In alcuni casi, la formazione di oligomeri o le fibrille può andare in un gran numero di direzioni, generante i tipi differenti di costruzioni che hanno beni varianti, secondo gli stati della sintesi. La standardizzazione questi metodi come pure della caratterizzazione della costruzione fa parte della sfida che affrontiamo.

Siete che pianificazione ampliare la gamma di prodotti? In caso affermativo, che le proteine voi metteranno a fuoco dopo sopra e perché?

Sì, sviluppare nuove le costruzioni è un trattamento in corso. Vogliamo potere discriminare fra le costruzioni fibrillari, per esempio, quali fra i due tipi di fibrille dell'alfa-synuclein, in modo da di noi stanno sviluppando gli anticorpi per fare quello.

In futuro immediato, uno degli sforzi principali sta andando essere con gli oligomeri. Abbiamo lanciato gli oligomeri della dopamina, che ha causato la comprensione più veloce di tutti i nuovi prodotti in nostra cronologia.

Egualmente vogliamo fare altre versioni che sono indotte dalle componenti fisiche piuttosto che le modifiche covalenti. Inoltre, vogliamo fare le costruzioni che sono più artificiali ed indotte dalle piccole molecole.

Infine, vogliamo creare qualcosa che sia stabile come possibile che mimi che cosa accade in realtà; dal momento che non conosciamo quale costruzione che è. Può bene essere l'opzione della dopamina, ma determinare quello è nel dominio dei ricercatori della malattia del Parkinson. Prepareremo, presenteremo e forniremo i vari oligomeri. Alcuno di questo conterà su collaborazione con altre organizzazioni, che è qualcosa che siamo sempre entusiasta fare.

Pianificazione preparare gli anticorpi per tutte le costruzioni per differenziarle. Dal momento che, abbiamo uno che sembra identificare gli oligomeri. Abbiamo fatto parecchi progetti su queste costruzioni ed abbiamo schermato i centinaia di candidati, ma abbiamo finora soltanto un anticorpo. Ciò è un'altra area dove vediamo il potenziale.

Gli oligomeri sono il modo di andata e sono risultato essere uno sforzo complesso. Devono essere fatti ed essere caratterizzati correttamente e qualsiasi sintesi data può generare più di una popolazione. Forse potremo fornire più di una popolazione degli oligomeri presto - questo fa parte del nostri scopo ed impegno al settore della ricerca.

Dove possono i nostri lettori trovare più informazioni?

Circa Ariel Louwrier, Ph.D.

ArielAriel Louwrier è il presidente e direttore generale di StressMarq Biosciences Inc., una società basata su Port Victoria, Canada di scienze biologiche. La società si specializza nei prodotti della ricerca per la ricerca neurodegenerative di malattia. Ariel tiene un Ph.D. in biochimica dall'università di risonanza (Regno Unito) ed è un collega corporativo dell'internazionale della società di sforzo delle cellule.

Kate Anderton

Written by

Kate Anderton

Kate Anderton is a Biomedical Sciences graduate (B.Sc.) from Lancaster University. She manages the editorial content on News-Medical and carries out interviews with world-renowned medical and life sciences researchers. She also interviews innovative industry leaders who are helping to bring the next generation of medical technologies to market.

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