Estudando a doença de Alzheimer e de Parkinson usando fibrilas pré-formadas

insights from industryAriel Louwrier, Ph.D.PresidentStressMarq Biosciences Inc.

Uma entrevista com Ariel Louwrier, Ph.D., discutindo a revelação de fibrilas pré-formadas para a pesquisa em desordens neurodegenerative tais como a doença de Alzheimer e de Parkinson.

Que nós sabemos sobre os papéis da tau e do Alfa-Synuclein no cérebro humano saudável?

Infelizmente, pouco é sabido sobre este assunto. Nós sabemos que a tau está envolvida na formação do microtubule, que permite que uma fonte de bens alcance pilhas e as mantenha saudáveis. Na doença de Alzheimer, a tau torna-se hyper-phosphorylated, causando a degeneração neurofibrillary e subseqüentemente, morte celular.

Nós conhecemos esse alfa-synuclein, uma proteína do bloco de apartamentos do monómero, somos abundantes no cérebro. Existe em uma variedade de formulários que incluem oligómero, fibrilas, e os depósitos maiores nos pacientes que sofrem da doença de Parkinson ou os sistemas múltiplos atrofiam (MSA).

O Alfa-synuclein acumula para formar os corpos de Lewy ou os neurites de Lewy, que podem ser circulares ou alongados na estrutura. Nós acreditamos que estes corpos de Lewy são tóxicos e involvidos na matança dos neurônios dopaminergic, conduzindo à revelação de desordens de movimento como a doença de Parkinson.

Totais, estas são as proteínas muito complicadas que podem formar multimers um com o otro. São dependentes dos estados da fosforilação e de outras alterações cargo-translational, que podem ser bastante complexos.

Corpos de Lewy - ilustraçãoCrédito de imagem: medistock/Shutterstock.com

Como podem as fibrilas pré-formadas activas ser usadas para estudar a doença de Alzheimer e de Parkinson?

As fibrilas pré-formadas são as ferramentas que permitem que os cientistas imitem os efeitos pathophysiological da doença de Alzheimer e de Parkinson no cérebro. Sups-se que as fibrilas de recombinação poderiam ser sintetizadas e introduzido às pilhas para induzir a patologia da doença, permitindo que um modelo esteja desenvolvido.

As patologias podem ser induzidas pela tau ou pelo alfa-synuclein sobre-expressando endògena, ou usando os mutantes da tau ou do alfa-synuclein que agregam mais ràpida. Contudo, os animais transgénicos necessários para estas experiências podem tomar uns muitos tempos amadurecer-se, significando que as investigações podem ser processos longos. Ao contrário, injetar fibrilas pode induzir a patologia em apenas 30 dias.

(L) o alfa-synuclein PFFs do rato induz a patologia do alfa-synuclein cargo-injecção de 30 dias no cérebro do rato. (R) o mutante humano K18 PFFs de P301L induz a patologia da tau cargo-injecção de nove semanas no cérebro transgénico do rato de P301L.

(L) o alfa-synuclein PFFs do rato induz a patologia do alfa-synuclein cargo-injecção de 30 dias no cérebro do rato. (R) o mutante humano K18 PFFs de P301L induz a patologia da tau cargo-injecção de nove semanas no cérebro transgénico do rato de P301L.

Porque as fibrilas são de recombinação na natureza, esta gera ambas as oportunidades e desafios porque não são réplicas exactas das estruturas encontradas no cérebro. Por exemplo, se nós expressamos fibrilas em Escherichia Coli., o anfitrião não tem a maquinaria molecular para realizar as alterações da tradução que, em alguns casos, podem ser extremamente importantes e são uma parte inerente destas proteínas nos seres humanos. Inversamente, o facto de que estas diferenças existem permite a diferenciação clara de proteínas endógenas e exógenas.

Nós mostramos que as fibrilas estão pegadas não somente, por exemplo, por pilhas preliminares neurocortical, mas podemos igualmente ser transportados dentro destas pilhas. Isto é essencial para induzir a patologia associada com o Parkinson, que é detectado usar um phospho-anticorpo a uma corrente particular do ácido aminado na posição 129.

As fibrilas podem ser injectadas na cultura celular ou directamente no cérebro do roedor; permitindo que nós identifiquem e meçam a patologia, e dando a cientistas um modelo para testar candidatos novos da droga.

O alfa-synuclein fluorescente-etiquetado ATTO633 PFFs foi pegado, transportado no soma, e na agregação induzida do alfa-synuclein em pilhas preliminares neurocortical do rato. (L) Neurites se encheu com as sementes fluorescente-etiquetadas do alfa-synuclein em um sistema microfluidic da co-cultura após 24 horas. (R) sementes do Alfa-synuclein dentro do soma e dos neurites de pilhas preliminares neurocortical do rato após 24 horas. Cortesia da experiência e da imagem lactente de CellectriconO alfa-synuclein fluorescente-etiquetado ATTO633 PFFs foi pegado, transportado no soma, e na agregação induzida do alfa-synuclein em pilhas preliminares neurocortical do rato. (L) Neurites se encheu com as sementes fluorescente-etiquetadas do alfa-synuclein em um sistema microfluidic da co-cultura após 24 horas. (R) sementes do Alfa-synuclein dentro do soma e dos neurites de pilhas preliminares neurocortical do rato após 24 horas. Cortesia da experiência e da imagem lactente de Cellectricon.

Que outros métodos estão disponíveis para induzir o neurodegeneration in vivo? Como estes métodos comparam às fibrilas e aos oligómero pré-formados?

Uma maneira é introduzir genetically o alfa-synuclein a níveis mais altos. Alternativamente, o alfa-synuclein ou a tau podem ser introduzidos através da invasão do vírus. Através daqueles mecanismos, você pode igualmente introduzir as versões transformadas que são mais agressivas e acelerar o processo da agregação.

Nós usamos um conceito similar com as fibrilas. Por exemplo, uma das mutações na doença de Parkinson familiar está na posição 53 do ácido aminado. Nós fazemos as fibrilas do mutante de A53T, que são muito mais agressivas na agregação de semeação in vitro e in vivo do que o selvagem-tipo tradicional fibrilas. O uso das fibrilas é mais rápido e mais sofisticado do que o overexpression genético ou métodos de vector virais.

Nosso alvo é introduzir algo que está tão perto como possível ao que está no cérebro. As pilhas ajudam-nos com esta. Um grupo de investigação encontrou recentemente que as fibrilas introduzidas podem hydrolytically ser processadas - fendido - após ter incorporado as pilhas e podem se submeter a alterações da cargo-tradução também.

Com um objetivo similar na mente, nós fizemos uma construção da tau que fosse phosphorylated e o cargo-translationally alterado usando as pilhas F9. Fibrilizes independente sem indução. Este produto será lançado muito logo. Nós estamos muito interessados ver sua tomada, como é usada, e o que os resultados são.

As fibrilas tendem a formar as estruturas muito específicas que olham como hélices. São duas entidades torcidas em torno de se, chamado um filamento helicoidal emparelhado, embora as únicas costas torcidas igualmente existam. Nós crescemos alguns destes filamentos em andaimes lineares naturais, removíveis.

Anticorpos que atacam o neurônio de morteCrédito de imagem: Design_Cells/Shutterstock.com

Onde a empresa começou? Como estes produtos foram desenvolvidos?

Os esforços em relação à geração de ferramentas para a pesquisa neurodegenerative da doença começaram com um inquérito do email de um pesquisador na costa leste (EUA). Tinha sido encaminhada nossos detalhes por outra académico para quem nós tínhamos feito a algumas outras construções, em uma área que não não tivesse essencialmente nada fazer com neurociência.

O pesquisador quis ver se nós poderíamos fazer fibrilas pré-formadas do alfa-synuclein. Como um químico da proteína, eu pensei que este seria simples. Não há muitas empresas que tomarão um risco e tentarão coisas sem cobrar para ele, mas nós somos um delas.

Nós fizemos a construção e enviamo-la ao pesquisador, mas voltaram e disseram que não trabalhou. Tomou-nos seis ou sete meses para figurar para fora que nós tínhamos feito um tipo totalmente diferente da fibrila do que o que têm esperado. Esta era uma curva de aprendizagem enorme para nós porque a literatura aponta opressivamente a um único tipo de fibrila em que a maioria da pesquisa é baseada.

Nossos estudos sugeriram que houvesse pelo menos dois tipos de fibrilas, e que são muito diferentes de se. Há alguma literatura para apoiar isto, mas os pesquisadores supor normalmente que há um tipo que às vezes os trabalhos e não fazem às vezes. Contudo, o alvo dos pesquisadores não é geralmente fazer as ferramentas ou as fibrilas.

Estão distante mais interessados em avaliar eventos a jusante uma vez que as fibrilas foram introduzidas em um sistema vivo. Isto incluiria a tentativa neutralizar a geração de patologia usando seus próprios candidatos da droga. Contudo, o tipo da fibrila é crítico porque você não pode neutralizar uma patologia que não seja gerada no primeiro lugar!

Nós começamos a realizar que estava não somente lá uma oportunidade de uma perspectiva comercial, mas havia igualmente algo scientifically importante que estêve faltado que nós poderíamos fornecer à comunidade de pesquisa. Isso conduziu-nos traga este trajecto da revelação, e nós temos feito desde então a múltiplo tipos diferentes das fibrilas para aplicações diferentes, assim como fornecendo os monómeros.

Mais importante ainda, nunca houve um bom controle para algum deste trabalho. Quando nenhuma outra fibrila está disponível, os povos usam tradicional monómeros. Isto cria potencial uma edição, porque os monómeros querem auto-nucleate e o começam fibrilize no seus próprios, assim que enquanto são muito bem para uma experiência a curto prazo, podem ser inoportunos para um estudo a longo prazo.

Para resolver este, nós desenvolvemos um método para forçar um primo muito próximo do alfa-synuclein, chamado beta-synuclein, para fibrilize. É uma construção totalmente inerte, completamente artificial que não semeie o alfa-synuclein ou o próprio. Isto é a primeira vez que há um controle fibrillar disponível para toda a indústria. Sobre isto, nós fizemos anticorpos a estas construções.

Por que você o sentiu era importante adicionar oligómero dopamina-estabilizados a sua carteira?

Há umas limitações ao serviço público das fibrilas. Muitos delas são compreendidos deficientemente porque são insolúveis. Os jogadores principais no campo, tal como o Michael J. Fox Fundação, que faz um trabalho inacreditável na área, afirmam em suas publicações que as fibrilas exigem o sonication as derrubar a um determinado tamanho (comprimento) a fim ser usado nas experiências.

O Sonication é um processo violento. Envolve a criação das microbolhas que desmoronam entre as temperaturas que nós associaríamos geralmente com o centro do sol - um a dois milhão graus centígrado. Claramente, os resultados são que há uma quantidade enorme de esforço oxidativo que vai sobre, algo que não é considerado frequentemente quando estas fibrilas são usadas.

Além disso, o que nós sabemos sobre o alfa-synuclein revolve em torno das pilhas dopamina-geradas. Assim, nós quisemos poder olhar “mais cedo” no processo antes que as fibrilas estejam feitas, quando os monómeros compo os oligómero solúveis - um formulário diferente da proteína agregada às fibrilas.

Há uma opinião geral na indústria que os oligómero são as espécies tóxicas. os oligómero Dopamina-estabilizados eram os primeiros a ser manufacturados e lançados porque são provavelmente mais biològica relevantes do que outros tipos.

(L) TEM de oligómero Dopamina-Estabilizados do Alfa-Synuclein (R) TEM do Alfa-Synuclein PFFs de A53T.(L) TEM de oligómero Dopamina-Estabilizados do Alfa-Synuclein (R) TEM do Alfa-Synuclein PFFs de A53T.

Como devem as fibrilas pré-formadas ser preparadas para o uso? Por que é o sonication importante aqui?

Depende da construção que está sendo usada. Em linhas gerais, os dois métodos necessários para fazer fibrilas são purificação e agitação. Os primeiros monómeros são refinados, e então o ambiente torna-se crítico, como este determina o que acontece em seguida. Os monómeros precisam de ser agitados por dias, que acelera o processo do fibrillization.

Os monómeros agregam para formar oligómero, oligómero do protofibril, e alongam finalmente em fibrilas.Os monómeros agregam para formar oligómero, oligómero do protofibril, e alongam finalmente em fibrilas.

Os nuances nestes métodos são muito importantes; por exemplo, que o andaime está sendo usado? Se o andaime não pode ser removido, aquele introduzirá um outro factor e acelerará mais geração dessa construção particular fora de seu controle?

Como eu mencionei mais cedo - o sonication é pensado frequentemente de como sendo necessário como um método que permita a redução do tamanho da fibrila a um nível onde possa provavelmente gerar a patologia. Nós pensamos que este é provavelmente um produto manufacturado do que é realmente relevante, que é solubilization das fibrilas. Isto ocorre durante o sonication. Uma vez que as diferença de fase (solúveis e insolúveis) foram removidas entre a espécie monomeric e fibrillar, todas as limitações difusíveis associadas com aquelas duas fases estão reduzidas ou removidas.

Por que é importante para fibrilas pré-formadas seletas de uma espécie apropriada?

Finalmente a maioria de povos querem trabalhar com construções humanas. Contudo, os povos trabalham nos roedores em uma fase mais adiantada. Os roedores são caracterizados bem e há muitas construções transgénicas disponíveis.

Pode igualmente fazer mais sentido para que os pesquisadores ponham uma construção do rato em um rato um pouco do que uma construção humana em um rato. A experiência final tem apenas uma variável, e enquanto este não é sempre possível in vivo, é o que os pesquisadores estão tentando conseguir e este permite que seja uma etapa mais perto desse paradigma.

Ter mais de uma construção a escolher do pode ser muito útil porque algumas versões são mais agressivas. Há, por exemplo, as construções do ser humano que contêm mutações para as fazer mais como a construção do rato, que é mais agressiva do que uma construção humana. Finalmente, os pesquisadores querem geralmente mover-se no sentido que lhes dá os dados relevantes à condição humana.

Nós colaboramos com a CTOC para testar construções do ser humano e do rato nos ratos. Com as construções do rato, a patologia pode ser considerada não somente no local da injecção mas em toda parte no cérebro em todos os casos após 30 dias. Isto é importante porque mostra que a patologia pode espalhar.

Ao contrário, contudo, quando você usa a versão humana, a semeação é menos agressiva e assim que a patologia torna-se em uma taxa muito mais lenta. Depois que a injecção com construções do ser humano, patologia se torna em aproximadamente 25 por cento dos ratos após 30 dias comparados a 100 por cento dos ratos injetados com a construção do rato. Em algumas aplicações, o tempo é importante, e este é quando usar um método mais rápido da geração da patologia pode apelar.

Que outro pré-formou fibrilas e monómeros você oferece?

Nós temos um número outros fibrilas e de monómeros que incluem o dismutase (TTR) 1 do transythyretin e do superoxidase (SOD1). Em termos da tau, nós igualmente temos versões e tamanhos diferentes.

Há uma outra proteína de TDP-43 chamado interesse que é importante na doença de Alzheimer. Aquele é difícil que nós não pudemos fazer com sucesso ainda.

Em alguns casos, a formação de oligómero ou as fibrilas podem ir em uma multidão de sentidos, gerando tipos diferentes de construções que têm propriedades de variação, segundo condições da síntese. Estandardizar estes métodos assim como a caracterização da construção é parte do desafio que nós enfrentamos.

É você que planeia expandir a gama de produtos? Em caso afirmativo, que as proteínas você estarão focalizando sobre em seguida e porque?

Sim, desenvolver construções novas é um processo em curso. Nós queremos poder discriminar entre construções fibrillar, por exemplo, como entre os dois tipos de fibrilas do alfa-synuclein, assim que de nós estão desenvolvendo anticorpos para fazer isso.

No futuro imediato, um dos esforços principais está indo ser com oligómero. Nós lançamos os oligómero da dopamina, que causou a tomada a mais rápida de todos os produtos novos em nossa história.

Nós igualmente queremos fazer outras versões que são induzidas por componentes físicos um pouco do que alterações covalent. Além, nós queremos fazer as construções que são mais artificiais e induzidas por moléculas pequenas.

Finalmente, nós queremos criar algo que é tão estável como possível que indicações o que acontece na vida real; no momento em que nós não conhecemos qual a construção que é. Pode bem ser a opção da dopamina, mas determinar isso está no domínio de pesquisadores da doença de Parkinson. Nós faremos, introduziremos, e forneceremos vários oligómero. Alguma desta confiará na colaboração com outras organizações, que é algo que nós somos sempre afiados fazer.

Nós planeamos fazer anticorpos para todas as construções a fim diferenciá-las. No momento em que, nós temos um que parece identificar oligómero. Nós fizemos diversos projectos nestas construções e seleccionamos centenas de candidatos, mas nós temos somente um anticorpo até agora. Esta é uma outra área onde nós ver o potencial.

Os oligómero são a maneira dianteira e provaram ser um esforço complicado. Precisam de ser feitos e caracterizado correctamente, e qualquer síntese dada pode gerar mais de uma população. Talvez nós poderemos fornecer logo mais de uma população dos oligómero - esta é parte de nossos alvo e comprometimento ao sector da pesquisa.

Onde podem nossos leitores encontrar mais informação?

Sobre Ariel Louwrier, Ph.D.

ArielAriel Louwrier é a presidente e director geral de StressMarq Ciências biológicas Inc., uma empresa das ciências da vida baseada em Victoria, Canadá. A empresa especializa-se em produtos da pesquisa para a pesquisa neurodegenerative da doença. Ariel guardara um Ph.D. na bioquímica da universidade de Kent (Reino Unido), e é um companheiro corporativo do International da sociedade do esforço da pilha.

Kate Anderton

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Kate Anderton

Kate Anderton is a Biomedical Sciences graduate (B.Sc.) from Lancaster University. She manages the editorial content on News-Medical and carries out interviews with world-renowned medical and life sciences researchers. She also interviews innovative industry leaders who are helping to bring the next generation of medical technologies to market.

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