Estudiar la enfermedad de Alzheimer y de Parkinson usando las fibrillas preformadas

insights from industryAriel Louwrier, Ph.D.PresidentStressMarq Biosciences Inc.

Una entrevista con Ariel Louwrier, Ph.D., discutiendo el revelado de las fibrillas preformadas para la investigación en desordenes neurodegenerative tales como enfermedad de Alzheimer y de Parkinson.

¿Qué sabemos sobre el papeles del Tau y de la Alfa-Synuclein en el cerebro humano sano?

Lamentablemente, poco se sabe sobre este tema. Sabemos que el tau está implicado en la formación del microtubule, que permite que un abastecimiento de mercancías alcance las células y las mantenga sanas. En enfermedad de Alzheimer, el tau llega a ser híper-phosphorylated, causando la degeneración neurofibrillary y posteriormente, muerte celular.

Conocemos esa alfa-synuclein, una proteína de la edificio-cuadra del monómero, somos abundantes en el cerebro. Existe en una variedad de formas incluyendo los oligómeros, fibrillas, y depósitos más grandes en los pacientes que sufren de la enfermedad de Parkinson o los sistemas múltiples atrofían (MSA).

La Alfa-synuclein acumula para formar las carrocerías de Lewy o los neurites de Lewy, que pueden ser circulares o alargados en estructura. Creemos que estas carrocerías de Lewy están tóxicas e implicadas en la matanza de neuronas dopaminérgicas, llevando al revelado de los desordenes de movimiento como la enfermedad de Parkinson.

Totales, éstas son las proteínas muy complicadas que pueden formar multimers con uno a. Son relacionadas en los estados de la fosforilación y otras modificaciones poste-de translación, que pueden ser muy complejos.

Carrocerías de Lewy - ejemploHaber de imagen: medistock/Shutterstock.com

¿Cómo se pueden las fibrillas preformadas activas utilizar para estudiar la enfermedad de Alzheimer y de Parkinson?

Las fibrillas preformadas son las herramientas que permiten que los científicos imiten los efectos patofisiológicos de la enfermedad de Alzheimer y de Parkinson en el cerebro. Fue presumido que las fibrillas recombinantes se podrían sintetizar e introducir a las células para inducir la patología de la enfermedad, permitiendo que un modelo sea desarrollado.

Las patologías se pueden inducir por el tau o la alfa-synuclein de sobre-expresión endógeno, o usando los mutantes del tau o de la alfa-synuclein que agregan más rápidamente. Sin embargo, los animales transgénicos necesarios para estos experimentos pueden tardar un tiempo largo para madurarse, significando que las investigaciones pueden ser procesos muy largos. En cambio, la inyección de las fibrillas puede inducir la patología en tan poco tiempo como 30 días.

(l) La alfa-synuclein PFFs del ratón induce la patología de la alfa-synuclein poste-inyección de 30 días en cerebro de la rata. (r) El mutante humano K18 PFFs de P301L induce la patología del tau poste-inyección de nueve semanas en cerebro transgénico del ratón de P301L.

(l) La alfa-synuclein PFFs del ratón induce la patología de la alfa-synuclein poste-inyección de 30 días en cerebro de la rata. (r) El mutante humano K18 PFFs de P301L induce la patología del tau poste-inyección de nueve semanas en cerebro transgénico del ratón de P301L.

Pues las fibrillas son recombinantes en naturaleza, ésta genera ambas oportunidades y retos pues no son reproducciones exactas de las estructuras encontradas en el cerebro. Por ejemplo, si expresamos las fibrillas en Escherichia Coli., el ordenador principal no tiene la maquinaria molecular para realizar las modificaciones de la traslación que, a veces, pueden ser extremadamente importantes y son una parte inherente de estas proteínas en seres humanos. Inversamente, el hecho de que existan estas diferencias permite la diferenciación sin obstrucción de proteínas endógenas y exógenas.

Hemos mostrado que las fibrillas no sólo son tomadas, por ejemplo, por las células primarias neurocortical, pero podemos también ser transportados dentro de estas células. Esto es esencial para inducir la patología asociada a Parkinson, que se descubre usando un phospho-anticuerpo a una cadena determinada del aminoácido en la posición 129.

Las fibrillas se pueden inyectar en cultivo celular o directamente en el cerebro del roedor; permitiendo que determinemos y que midamos la patología, y dando a científicos un modelo para probar a nuevos candidatos de la droga.

La alfa-synuclein fluorescente-etiqueta ATTO633 PFFs fue tomada, transportado en el soma, y la agregación inducida de la alfa-synuclein en células primarias neurocortical del ratón. (l) Neurites llenó de las semillas fluorescente-etiqueta de la alfa-synuclein en un sistema microfluidic de la co-cultura después de 24 horas. (r) Semillas de la Alfa-synuclein dentro del soma y de los neurites de las células primarias neurocortical del ratón después de 24 horas. Cortesía del experimento y de la proyección de imagen de CellectriconLa alfa-synuclein fluorescente-etiqueta ATTO633 PFFs fue tomada, transportado en el soma, y la agregación inducida de la alfa-synuclein en células primarias neurocortical del ratón. (l) Neurites llenó de las semillas fluorescente-etiqueta de la alfa-synuclein en un sistema microfluidic de la co-cultura después de 24 horas. (r) Semillas de la Alfa-synuclein dentro del soma y de los neurites de las células primarias neurocortical del ratón después de 24 horas. Cortesía del experimento y de la proyección de imagen de Cellectricon.

¿Cuál otros métodos están disponibles para inducir el neurodegeneration in vivo? ¿Cómo estos métodos comparan a las fibrillas y a los oligómeros preformados?

Una manera es introducir alfa-synuclein en niveles más altos genético. Alternativamente, la alfa-synuclein o el tau se puede introducir vía la invasión del virus. A través de esos mecanismos, usted puede también introducir las versiones transformadas que son más agresivas y acelerar el proceso de la agregación.

Utilizamos un concepto similar con las fibrillas. Por ejemplo, una de las mutaciones en la enfermedad de Parkinson familiar está en la posición 53 del aminoácido. Hacemos las fibrillas del mutante de A53T, que son mucho más agresivas en la agregación sembrada in vitro y in vivo que el salvaje-tipo tradicional fibrillas. El uso de fibrillas es más rápido y más sofisticado que el énfasis excesivo genético o métodos de vector virales.

Nuestro objetivo es introducir algo que está tan cerca como posible a cuál está en el cerebro. Las células nos ayudan con esto. Un grupo de investigación encontró recientemente que las fibrillas introducidas se pueden hidrolítico tramitar - hendido - después de incorporar las células y pueden experimentar modificaciones de la poste-traslación también.

Con una meta similar en mente, hemos hecho una construcción del tau que es phosphorylated y el poste-de translación modificado usando las células F9. Fibrilizes independientemente sin la inducción. Este producto será lanzado muy pronto. Estamos muy interesados ver su absorción, cómo se utiliza, y cuáles los resultados son.

Las fibrillas tienden a formar las estructuras muy específicas que parecen hélices. Son dos entidades torcidas alrededor de uno a, llamado un filamento espiral emparejado, aunque existan los únicos cabos torcidos también. Hemos crecido algunos de estos filamentos en andamios lineales naturales, que se puede quitar.

Anticuerpos que atacan la neurona de muerteHaber de imagen: Design_Cells/Shutterstock.com

¿Dónde la compañía comenzó? ¿Cómo estos productos fueron desarrollados?

Los esfuerzos referentes a la generación de herramientas para la investigación neurodegenerative de la enfermedad comenzaron con una pregunta del correo electrónico de un investigador en la costa este (los E.E.U.U.). Otro academic para quien habíamos hecho algunas otras construcciones, en un área le había remitido a nuestros detalles que no tenía esencialmente nada hacer con neurología.

El investigador quiso ver si podríamos hacer las fibrillas preformadas de la alfa-synuclein. Como químico de la proteína, pensé que éste sería simple. No hay muchas compañías que tomarán un riesgo e intentarán cosas sin cargar para él, pero somos una de ellas.

Hicimos la construcción y la enviamos al investigador, pero se volvieron y dijeron que no trabajó. Nos tardó seis o siete meses para imaginar que habíamos hecho un tipo totalmente diverso de la fibrilla que qué habían estado preveyendo. Esto era una curva de aprendizaje enorme para nosotros porque la literatura apunta de forma aplastante a un único tipo de fibrilla en el cual la mayor parte de la investigación se base.

Nuestros estudios sugirieron que haya por lo menos dos tipos de fibrillas, y que son muy diferentes de uno a. Hay un poco de literatura para soportar esto, pero los investigadores asumen normalmente que hay un tipo que a veces no lo hacen los trabajos y a veces. Sin embargo, el objetivo de investigadores no es generalmente hacer las herramientas o las fibrillas.

Están lejos más interesadas en fijar acciones rio abajo una vez que las fibrillas se han introducido en un sistema vivo. Esto incluiría la tentativa neutralizar la generación de patología usando sus propios candidatos de la droga. ¡Sin embargo, el tipo de la fibrilla es crítico pues usted no puede neutralizar una patología que no se ha generado en el primer lugar!

Comenzamos a realizar que no sólo estaba allí una oportunidad de una perspectiva comercial, pero había también algo científico importante que se ha faltado que podríamos ofrecer a la comunidad de investigación. Eso nos llevó derriba este camino del revelado, y desde entonces hemos hecho múltiplo diversos tipos de las fibrillas para diversos usos, así como suministrando los monómeros.

Más importante, nunca ha habido un buen mando para ninguno de este trabajo. Cuando no hay otra fibrilla disponible, la gente utiliza tradicionalmente los monómeros. Esto potencialmente crea una entrega, pues los monómeros quieren uno mismo-nucleado y comienzan a fibrilize en sus los propio, así que mientras que están muy bien para un experimento a corto plazo, pueden ser inadecuados para un estudio a largo plazo.

Para resolver esto, desarrollamos un método para forzar a un primo muy cercano de la alfa-synuclein, llamado beta-synuclein, para fibrilize. Es una construcción totalmente inerte, totalmente artificial que no siembra la alfa-synuclein o sí mismo. Éste es la primera vez que hay un mando fibriloso disponible para cualquier industria. Encima de esto, hemos hecho los anticuerpos a estas construcciones.

¿Por qué usted lo aserraba al hilo era importante agregar los oligómeros dopamina-estabilizados a su cartera?

Hay limitaciones a la utilidad de fibrillas. Muchas de ellas son mal entendidas porque son insolubles. Los jugadores mayores en el campo, tal como el Michael J. Fox Foundation, que hace un trabajo increíble en el área, afirman en sus publicaciones que las fibrillas requieren la sonicación derribarlas a cierta talla (largo) para ser utilizado en experimentos.

La sonicación es un proceso violento. Implica la creación de las microburbujas que se desploman en medio de las temperaturas que asociaríamos generalmente al centro del sol - un a dos millones de grados centígrado. Sin obstrucción, los resultados son que hay una cantidad enorme de tensión oxidativa que continúa, algo que no se considera a menudo cuando se utilizan estas fibrillas.

Además, qué sabemos sobre la alfa-synuclein gira alrededor de las células dopamina-generadas. Así pues, quisimos poder observar “anterior” en el proceso antes de que se hagan las fibrillas, cuando los monómeros componen los oligómeros solubles - una diversa forma de la proteína agregada a las fibrillas.

Hay una creencia general en la industria que los oligómeros son las especies tóxicas. los oligómeros Dopamina-estabilizados eran los primeros que se fabricarán y ser lanzado porque son probablemente más biológico relevantes que otros tipos.

(l) TEM de los oligómeros Dopamina-Estabilizados de la Alfa-Synuclein (r) TEM de la Alfa-Synuclein PFFs de A53T.(l) TEM de los oligómeros Dopamina-Estabilizados de la Alfa-Synuclein (r) TEM de la Alfa-Synuclein PFFs de A53T.

¿Cómo se deben las fibrillas preformadas preparar para el uso? ¿Por qué es la sonicación importante aquí?

Depende de la construcción que es utilizada. Hablando en términos generales, los dos métodos necesarios para hacer las fibrillas son purificación y sacudida. Se purifican los primeros monómeros, y entonces el ambiente llega a ser crítico, como éste determina qué suceso después. Los monómeros necesitan ser sacudidos por días, que acelera el proceso del fibrillization.

Los monómeros agregan para formar los oligómeros, oligómeros del protofibril, y alargan final en las fibrillas.Los monómeros agregan para formar los oligómeros, oligómeros del protofibril, y alargan final en las fibrillas.

Los matices en estos métodos son muy importantes; ¿por ejemplo, que el andamio se está utilizando? ¿Si el andamio no puede ser quitado, ése introducirá otro factor y acelerará más generación de esa construcción determinada fuera de su mando?

Como mencioné anterior - la sonicación se piensa a menudo en como siendo necesaria como método que permita la reducción de la talla de la fibrilla a un nivel donde está probablemente capaz de generar la patología. Pensamos que éste es probablemente un artefacto de cuál es realmente relevante, que es solubilidad de las fibrillas. Esto ocurre durante la sonicación. Una vez que las diferencias de fase (solubles e insolubles) se han quitado entre la especie monomérica y fibrilosa, cualquier limitación difusional asociada a esas dos fases se reduce o se quita.

¿Por qué es importante para las fibrillas preformadas selectas de una especie apropiada?

La mayoría de la gente quiere final trabajar con las construcciones humanas. Sin embargo, la gente trabaja en roedores en un primero tiempo. Los roedores se caracterizan bien y hay muchas construcciones transgénicas disponibles.

Puede también tener más sentido para que los investigadores pongan una construcción del ratón en un ratón bastante que una construcción humana en un ratón. El experimento final tiene apenas una variable, y mientras que esto no es siempre posible in vivo, es lo que están intentando los investigadores lograr y esto permite que él sea un paso más cercano a ese paradigma.

Tener más de una construcción a elegir de puede ser muy útil porque algunas versiones son más agresivas. Hay, por ejemplo, las construcciones del ser humano que contienen mutaciones para hacerlas más bién la construcción del ratón, que es más agresiva que una construcción humana. Final, los investigadores quieren generalmente moverse en la dirección que les da los datos relevantes a la condición humana.

Colaboramos con la CRO (COORDINADORA) para probar construcciones del ser humano y del ratón en ratones. Con las construcciones del ratón, la patología se puede considerar no sólo en el sitio de la inyección pero por todas partes en el cerebro en todos los casos después de 30 días. Esto es importante pues muestra que la patología puede extenderse.

En cambio, sin embargo, cuando usted utiliza la versión humana, el sembrador es menos agresivo y así que la patología se convierte a un régimen mucho más lento. Después de que la inyección con las construcciones del ser humano, patología se convierta en el cerca de 25 por ciento de las ratas después de 30 días comparados al 100 por ciento de las ratas inyectadas con la construcción del ratón. En algunos usos, el tiempo es importante, y éste es cuando usar un método más rápido de generación de la patología puede apelar.

¿Qué otro preformó las fibrillas y los monómeros usted ofrece?

Tenemos varias otras fibrillas y monómeros incluyendo la dismutasa (TTR) 1 (SOD1) del transythyretin y del superoxidase. En términos de tau, también tenemos diversas versiones y tallas.

Hay otra proteína de TDP-43 llamado interés que sea importante en enfermedad de Alzheimer. Ése es difícil que no hemos podido hacer con éxito todavía.

En algunos casos, la formación de oligómeros o las fibrillas puede entrar en una multitud de direcciones, generando diversos tipos de construcciones que tengan propiedades diversas, dependiendo de condiciones de la síntesis. Estandardizar estos métodos así como la caracterización de la construcción es parte del reto que hacemos frente.

¿Es usted que proyecta desplegar la gama de productos? ¿Si es así que las proteínas usted enfocarán conectado después y porqué?

Sí, desarrollar nuevas construcciones es un proceso en curso. Queremos poder discriminar entre las construcciones fibrilosas, por ejemplo, por ejemplo entre los dos tipos de fibrillas de la alfa-synuclein, así que de nosotros están desarrollando los anticuerpos para hacer eso.

En el futuro inmediato, uno de los esfuerzos principales va a estar con los oligómeros. Hemos lanzado los oligómeros de la dopamina, que ha causado la absorción más rápida de cualquier nuevo producto en nuestra historia.

También queremos hacer otras versiones que sean inducidas por los componentes físicos bastante que modificaciones covalentes. Además, queremos hacer las construcciones que son más artificiales e inducidas por las pequeñas moléculas.

Final, queremos crear algo que es tan estable como sea posible que los imitadores qué suceso en la vida real; en el momento que no conocemos cuál la construcción que es. Bien puede ser la opción de la dopamina, pero la determinación de eso está en el dominio de los investigadores de la enfermedad de Parkinson. Haremos, introduciremos, y ofreceremos los diversos oligómeros. Algo de esto confiará en la colaboración con otras organizaciones, que es algo que somos siempre afilados hacer.

Proyectamos hacer los anticuerpos para todas las construcciones para distinguirlas. En el momento que, tenemos uno que parezca determinar los oligómeros. Hemos hecho varios proyectos sobre estas construcciones y hemos revisado a centenares de candidatos, pero tenemos solamente un anticuerpo hasta ahora. Ésta es otra área donde vemos potencial.

Los oligómeros son la manera delantera y han demostrado ser un esfuerzo difícil. Necesitan ser hechos y ser caracterizados correctamente, y cualquier síntesis dada puede generar más de una población. Quizás podremos ofrecer más de una población de oligómeros pronto - éste es parte de nuestro objetivo y consolidación al sector de la investigación.

¿Dónde pueden nuestros programas de lectura encontrar más información?

Sobre Ariel Louwrier, Ph.D.

ArielAriel Louwrier es el Presidente y Director General de StressMarq Biosciences Inc., una compañía de las ciencias de la vida basada en Victoria, Canadá. La compañía se especializa en los productos de la investigación para la investigación neurodegenerative de la enfermedad. Ariel espera un Ph.D. en bioquímica de la universidad de Kent (Reino Unido), y es una persona de la corporación del International de la sociedad de la tensión de la célula.

Kate Anderton

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Kate Anderton

Kate Anderton is a Biomedical Sciences graduate (B.Sc.) from Lancaster University. She manages the editorial content on News-Medical and carries out interviews with world-renowned medical and life sciences researchers. She also interviews innovative industry leaders who are helping to bring the next generation of medical technologies to market.

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