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Análise sensível dos açúcares com detecção HPLC-Electroquímica

insights from industryDr, Kristin FolmertApplication & AcademyKnauer

Uma entrevista com Dr. Kristin Folmert, aplicação & academia, Knauer

Dê por favor uma vista geral da análise do açúcar com detecção HPLC-electroquímica.

Os hidratos de carbono tais como açúcares são uma classe importante de substâncias para o metabolismo, biologia estrutural e produção energética de pilhas. Conseqüentemente, igualmente jogam um papel fundamental em farmacêutico, em biológico e a ciência alimentar. Além disso, uma maneira progressiva de ciência é orientada para a produção energética na natureza do açúcar e tenta produzir combustíveis modernos, verdes das matérias primas biológicas. Com nosso sistema dedicado de AZURA HPAEC nós desenvolvemos métodos para apoiar estes ramos importantes da ciência com definição ultra-alta e a analítica segura.

Créditos de imagem: qoppi | Shutterstock

Os hidratos de carbono são ácidos fracos com valores do pKa entre 12 e 14. Conseqüentemente, podem para ionizar-se completamente ou parcialmente sob circunstâncias básicas com pH >12. Devido a estas circunstâncias ásperas, somente as colunas poliméricos da troca de aníon são apropriadas para a análise do hidrato de carbono. O tempo de retenção com AZURA HPAEC é correlacionado inversa com o valor do pKa e aumenta significativamente com o peso molecular do hidrato de carbono.

Como a detecção electroquímica difere de outros métodos de detecção? Que são as vantagens e as limitações de usar a detecção electroquímica?

Os métodos de detecção os mais comuns na cromatografia líquida são UV, PAIZINHO, fluorescência e detecção do MS. Contudo, a maioria de hidratos de carbono não têm grupos do cromóforo e não podem conseqüentemente ser detectados por métodos da absorção ou da espectroscopia de emissão. Para usar uma destas técnicas populares uma etapa da derivatização antes ou depois da coluna seria necessária. Isto exigiria a revelação especial do equipamento e do método. Frequentemente esta derivatização igualmente agrava a definição da separação. A detecção do MS, por outro lado, é muito de custo elevado. Além, os solventes usados para a separação do LC do açúcar não são frequentemente fáceis evaporar e fazer assim a detecção de alta resolução difícil.

Um detector do R.I. (RI) é uma alternativa aos métodos mencionados, que seja igualmente muito fácil de usar e barata comprar. Contudo, os detectores de RI são não específicos em sua detecção e têm uma sensibilidade significativamente mais baixa e assim uns limites de detecção mais ruins (LOD) comparados aos outros métodos de detecção.

Uma outra alternativa é detecção com um detector evaporativo da dispersão de luz (ELSD). O ELSD é mais sensível do que LIVRADO, mas ainda menos sensível do que a detecção electroquímica (ECD). A revelação do método com um ELSD é bastante simples enquanto o eluente é mais fácil de evaporar do que os analytes. Contudo, para ELSD uma constante, o córrego altamente puro do nitrogênio é necessária, que faz a aplicação bastante cara.

ECD aproveita-se do facto que os hidratos de carbono estam presente na solução em um equilíbrio dos redox. A amperometria usa este facto para a detecção quantitativa altamente sensível. Uma corrente da electrólise é medida em um eléctrodo de trabalho sob o potencial eletroquímico pulsado. A corrente da electrólise é proporcional à concentração analyte oxidado/reduzido. Segundo o analyte, a sensibilidade de ECD pode ser 1.000 a 5.000 vezes comparadas mais altamente à detecção de RI. Por outro lado, a detecção de RI é muito mais fácil de usar-se, não exige tais vezes longas da equilibração e a pilha de medição é menos sensível às mudanças no método. Contudo, o SenCell sensível no ECD tem a vantagem que seu volume pode individualmente ser adaptado às condições analíticas e até preparatórios do método do LC.

Dê por favor uma vista geral do sistema do HPLC-ECD de Knauer. Que características este sistema oferece aos pesquisadores?

O sistema de AZURA HPAEC é compor dos módulos do bioinert que não têm nenhum metal ou o vidro surge em contacto com o eluente para impedir a formação de íons de interferência. Nossas aplicações do hidrato de carbono foram executadas com um mostruário automático que pudesse refrigerar as amostras e uma bomba do LPG (inclinação de baixa pressão, quaternários). Contudo, o usuário pode escolher entre as bombas diferentes do bioinert e os métodos da injecção de acordo com suas necessidades. O coração do sistema é o detector eletroquímico de AZURA ECD 2,1. O detector pode moderar a pilha de medição para garantir o vigor do método. Ao mesmo tempo a coluna pode ser apertada no detector. Assim, o detector é igualmente um termostato da coluna. Isto reduz o volume inoperante e impede inclinações de temperatura. Os tipos diferentes da pilha de fluxo podem ser usados, que é especialmente importante se você quer comutar entre a amperometria pulsada e constante como um método de detecção para aplicações diferentes. As séries da pilha de fluxo do ouro de SenCell HyRef melhores para hidratos de carbono. O volume desta pilha de fluxo altamente sensível é variável muito fácil e permite que o usuário aperfeiçoe perfeitamente seu método. Outras vantagens desta pilha de fluxo são suas longevidade e limpeza fácil, que toma somente algumas actas. Aqui KNAUER tem vantagens claras para sistemas competitivos comparáveis.

Que faz o sistema do HPLC-ECD de Knauer tão sensível à detecção e à selecção de substâncias oxidáveis e reduzíveis?

Primeiramente, todo o analyte que puder ser oxidado ou reduzido é um candidato para a detecção electroquímica. A amperometria clássica trabalha descontìnua: enchendo o reactor, a medida ou a titulação, esvaziando o reactor, limpeza, regenerando, medida seguinte e assim por diante. Isso significa que não pode ser usado em combinação com a separação da HPLC. O sistema da cromatografia da análise do açúcar de KNAUER usa a detecção amperométrica pulsada (PAD) que inclui a regeneração do eléctrodo, exigida para a detecção do açúcar. Usando um volume de medição muito pequeno da pilha, esta técnica permite medidas rápidas em somente 500 milissegundos. Para realizar a sensibilidade a mais alta da detecção, uma configuração do três-eléctrodo é usada que consiste em um eléctrodo de trabalho, em um eléctrodo de referência e em um eléctrodo auxiliar. O eléctrodo auxiliar é mantido precisamente no mesmo potencial que o eléctrodo de referência através de uma braçadeira de tensão, compensando todos os efeitos de polarização que possam ocorrer nos eléctrodos. Junto com o volume extremamente pequeno da pilha do SenCell, que pode variàvel ser ajustado entre 0 a 300 NL, o AZURA ECD 2,1 é muito bom serido mesmo para aplicações da HPLC (U).  

forma de onda potencial da ALMOFADA de 4 etapas para a detecção de monosaccharides e de outros hidratos de carbono. A detecção da amostra ocorre durante o tsample destacado do período de tempo.

forma de onda potencial da ALMOFADA 4-step para a detecção de monosaccharides e de outros hidratos de carbono. A detecção da amostra ocorre durante o período de tempo destacado T.sample

Onde a análise do hidrato de carbono é usada dentro da indústria e por que é importante ter conhecido níveis do açúcar nos produtos que são produzidos?

Mono e polisacáridos, isto é as classes diferentes dos açúcares, seja extremamente versátil em suas propriedades. Devido a sua solubilidade de água, têm a boa disponibilidade biológica e são geralmente não-tóxicos. Na indústria farmacêutica, o açúcar é usado não somente como um ingrediente activo mas igualmente como um enchimento nas tabuletas ou como um aditivo nos sucos. Na indústria alimentar, os açúcares são usados como um edulcorante mas igualmente como um estabilizador sob a forma do amido. Há mal todo o alimento que não contiver algum formulário do açúcar. Os fabricantes no farmacêutico e as indústrias alimentares devem fornecer a informações exactas na natureza e na composição dos ingredientes. Com esta finalidade, os métodos analíticos são importantes que podem determinar todos os tipos de açúcares muito sensìvel e seguro. Outras substâncias que podem igualmente ser analisadas no mesmo modo e que são interessantes para a indústria são por exemplo aminoglycosides, álcoois alifáticos, ácidos aminados e glicoproteína.

Olhando especificamente na indústria de alimento e de bebidas, como pode o sistema do HPLC-ECD de Knauer ser usado para identificar açúcares diferentes, por exemplo separando a glicose, a fructose e a lactose?

Para distinguir a glicose, a fructose e a lactose de se são basicamente bastante simples. A chave é a coluna e o método direitos. As colunas da troca iónica são usadas normalmente para a análise do açúcar. Em combinação com a detecção electroquímica, deve naturalmente ser tomado para assegurar-se de que o material da coluna seja igualmente estável no estado básico. Por exemplo, a coluna do Na de Eurokat, que é alterada igualmente com solução do hidróxido de sódio, é recomendada aqui.

A qualidade de alimento, como propriedades físico-químicas dos alimentos tais como a doçura, aparência, estabilidade e textura depende do tipo e da concentração dos hidratos de carbono actuais. Para muitas perguntas na indústria alimentar, contudo, a detecção com um detector de RI é suficiente. Em alguns casos, por exemplo, a UE ou o FDA prescrevem os valores de limite muito baixo que devem ser declarados e então o detector de AZURA ECD 2,1 é a escolha direita. Um daqueles exemplos é lactose em produtos lactose-livres. O limite de detecção prescrito de 10 mg/100 g é alcançado assim facilmente e, com um LOD de 1,5 µg/100 g, distante abaixo. Isto dá o fabricante e o utilizador final a segurança necessária.

Curva de calibração para concentrações da lactose na escala de 2,18 μg/100g a 109,00 μg/100 G.

Curva de calibração para concentrações da lactose na escala de 2,18 μg/100g a 109,00 μg/100 G.

Por que é a análise sensível dos açúcares importante para a indústria farmacêutica?

Há ingredientes activos açúcar-baseados eficazes numerosos. Por exemplo, os antibióticos novos dos oligómero do açúcar são interessantes, ou quando o açúcar estiver usado em combinação com outras moléculas como lipidos ou proteínas para obter classes novas de ingredientes activos. Por exemplo, as glicoproteína, os glycolipids, e os proteoglycans são particularmente poderosos. A combinação de proteínas com os açúcares pode, por exemplo, aumentar a disponibilidade biológica ou melhorar o metabolismo. Um método analítico de alta resolução é particularmente importante para monitorar as baixas concentrações de substâncias activas no organismo ou para identificar produtos metabólicos.

Como a análise sensível do açúcar impacta a produção e a refinação do combustível biológico?

Em período da crise do clima e a escassez das matérias primas, a pesquisa está procurando alternativas novas para combustíveis eficazes verdes. Até agora, os combustíveis biológicos foram produzidos na maior parte da grão ou do milho e são conseqüentemente em competição com a produção alimentar. Além do que o desperdício da relvado e de alimento, o foco está no desperdício de madeira como uma fonte alternativa da matéria prima para a produção do combustível biológico. Apesar da fonte, as biomassas, ricas na celulose, sempre são divididas tèrmica ou quimicamente e então fermentaas enzymatically para obter uns mais baixos ou açúcares monomeric. No caso da madeira, o fucose dos açúcares, o rhamnose, a arabinose, a galactose, a glicose, o xylose e a manose assim como o ácido galacturonic do ácido dos ácidos do açúcar e o glucuronic são produzidos. Uma avaliação quantitativa dos produtos da decomposição é crucial para a avaliação do processo a fim calcular a eficácia da utilização da matéria prima. Isto é porque a proporção de hidratos de carbono diferentes é directamente proporcional ao rendimento do bioetanol gerado destes açúcares no passo seguinte. Além do que a confiança do método analítico para a investigação dos açúcares de madeira com detecção electroquímica, que nós descrevemos em uma aplicação (o https://www.knauer.net/en/sensitive-and-selective-analysis-of-wood-sugars-and-uronic-acids-for-biofuel-research-with-electrochemical-detection/a24748), o uso de eluente aquosos igualmente fala para o uso no este campo muito ecológico da pesquisa.

Cromatograma de uma mistura padrão que contem 0,1 mg/mL fucose (1), rhamnose (2), arabinose (3), galactose (4), glicose (5), xylose (6), manose (7), ácido galacturonic (8) e ácido glucuronic (9). E um zoom nos picos para os ácidos uronic.

Cromatograma de uma mistura padrão que contem 0,1 mg/mL fucose (1), rhamnose (2), arabinose (3), galactose (4), glicose (5), xylose (6), manose (7), ácido galacturonic (8) e ácido glucuronic (9). E um zoom nos picos para os ácidos uronic.

Que é o futuro de HPLC-ECD e de sistemas de análise do hidrato de carbono de KNAUER?

No momento em que nós estamos testando a coluna diferente dactilografa para aumentar a variedade de métodos para nosso sistema de AZURA HPAEC. Nós igualmente estamos explorando campos de aplicação novos. Os glutamato, cortisones ou aditivos polyphenol-baseados, por exemplo, seriam interessantes para a indústria alimentar. Para a indústria farmacêutica, por exemplo, os aminoglycosides são um assunto interessante para a pesquisa dos antibióticos que pode ser endereçada bem com detecção electroquímica.

Onde podem os leitores encontrar mais informação?

Por exemplo, nós estabelecemos uma secção do Q&A em nosso homepage onde os usuários podem encontrar respostas mais frequentemente às perguntas feitas sobre os métodos, a amperometria e o sistema (https://www.knauer.net/en/Support/FAQ/Detection?utm_source=DNL&utm_medium=email&utm_campaign=DNL109_2019-12#ECD). Para o sistema e o hidrato de carbono o assunto foi dedicado igualmente uma página separada onde você pode ler um pouco mais sobre ele (https://www.knauer.net/en/Food-Analysis/HPLC_ECD_Saccharides_Applications). E naturalmente, nós temos diversas notas de aplicação em nosso homepage sobre a análise do açúcar com tipos diferentes dos detectores e naturalmente com detecção electroquímica (https://www.knauer.net/en/Applications/applications-start).

Sobre o Dr. Kristin Folmert

Dr. Kristin FolmertO Dr. Kristin Folmert estudou a química no Freie Universität Berlim e recebeu seu mestre em 2012. Terminou então sua dissertação no FU Berlim até 2017 com o foco na análise de agregar peptides e moléculas photoresponsive. Desde 2018 tem trabalhado para KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH nas aplicações e no departamento da academia. Tarefas inclui a revelação do método da HPLC, os estudos de viabilidade e a representação regular de KNAUER nas feiras de comércio e nas conferências. É igualmente muito activa como um instrutor na academia de Knauer.

Citations

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    KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH. (2020, January 23). Análise sensível dos açúcares com detecção HPLC-Electroquímica. News-Medical. Retrieved on May 14, 2021 from https://www.news-medical.net/news/20200123/Sensitive-Analysis-of-Sugars-with-HPLC-Electrochemical-Detection.aspx.

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