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Prise de sang unicellulaire prénatale pour des anomalies du gène

Avec l'état actuel des connaissances concernant le dépistage génétique, le contrôle prénatal non envahissant (NIPT) est en faveur pour le dépistage génétique dans les bébés à venir, utilisant des fragments d'ADN diffusant dans le sang de la mère.

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L'électrophorèse en gel (PCR) d'amplification en chaîne par polymérase et d'agarose est une méthode d'électrophorèse en gel utilisée dans les biochimies, la biologie moléculaire, la génétique, et la chimie clinique dans le laboratoire. Crédit : Rattiya Thongdumhyu/Shutterstock

Maintenant un NIPT neuf a été rapporté dans le tourillon de la diagnose moléculaire en février 2020, qui fournit la preuve que l'analyse de l'ADN entière unicellulaire utilisant les cellules foetales sous tension rarement d'occurrence dans la circulation maternelle, basée sur une technique modifiée d'ACP, a la sensibilité et la spécificité élevées en captant des anomalies d'ADN. Ceci améliore les possibilités de trouver des anomalies génétiques foetales.

Schéma du système digital de l
A) Schéma du système digital de l'ACP de gouttelette unique unique cellule (Sc-ddPCR). Utilisant le système du ddPCR QX200, chaque cellule est simplement encapsulée dans une gouttelette. Jusqu'à 3.000 cellules selon le puits peuvent être individuellement encapsulées. Par la suite, le lysis de cellules et l'ACP avec des sondes et des amorces sont effectués dans chaque gouttelette. En conclusion, en mesurant les gouttelettes fluorescentes, l'ADN génomique unicellulaire peut être évalué. B) Confirmation de l'encapsulation unicellulaire après avoir produit des gouttelettes avec une ligne humaine de lymphocyte B. Gauche, dans le domaine lumineux ; droite, avec un filtre de Hoechst. C) Plot bidimensionnel d'amplitude de signe de sondes SRY et RPP30 dans chaque gouttelette trouvée utilisant notre système Sc-ddPCR modifié. Signalez l'amplitude de sondes avec 1× PBS comme contrôle neutre (est parti), ligne femelle humaine de lymphocyte B (HEV0230) comme contrôle négatif (moyen), et ligne mâle humaine de lymphocyte B (HEV0057) comme contrôle positif (droit). Crédit : Tourillon de la diagnose moléculaire

NIPTs - limitations

Contrairement aux tests invasifs aimez l'amniocentèse qui ont le potentiel pour le tort foetal, le NIPTs ont en service aujourd'hui beaucoup d'avantages comprenant l'absence des risques foetaux, mais ils ont également leurs limitations. Un des points faibles principaux est qu'ils fournissent parfois des caractéristiques non-utiles parce qu'ils examinent des fragments d'ADN, publiées des cellules foetales ou placentaires pendant leur perte. Ces morceaux d'ADN sont pour cette raison ADN sans cellule appelé ou cfDNA, plutôt que le génome entier. Ceci ne permet pas toujours à l'analyste de savoir si l'ADN vient des cellules ou du foetus de mère. Comme résultat, NIPT est un test de dépistage et pas des tests diagnostique définitifs.

Les scientifiques sont pour cette raison toujours sur la surveillance pour que meilleur NIPTs effectue une détermination concluante des anomalies génétiques foetales. La plupart de ces techniques dépendent de l'utilisation du cfDNA diffusant dans le sang de la mère à au-dessus de 4 pour cent. Les cellules foetales dans le sang de la mère sont dues extrêmement rare à l'efficacité élevée du barrage placentaire, et ceci lance un défi formidable à l'analyste. Pour augmenter les possibilités du dépistage de l'ADN foetal, beaucoup de tests se servent de l'amplification en chaîne par polymérase (PCR). C'est une méthode par laquelle un échantillon unique d'ADN est transformé par multiplication en les millions, initialement conçus par le biochimiste américain Kary Mullis, pour lequel il a été attribué le prix Nobel.

La technique neuve

L'étude actuelle a employé une forme modifiée de l'ACP digital de gouttelette unicellulaire (Sc-ddPCR). Utilisant quelques réglages à la technique fondamentale, ils ont produit la validation de principe que ceci peut évaluer le génome des cellules foetales trouvées dedans extrêmement - des concentrations inférieures dans la circulation maternelle, d'une prise de sang tirée d'une veine périphérique. Ceci a pu mener au développement d'un test pour évaluer l'ADN d'une cellule vivante directement de sang maternel, évitant les opérations de la fixation de cellules, la souillure de cellules et l'amplification du génome entier.

Explique le chercheur Kenichiro Hata, « nous ont observé que dans certains cas les résultats de NIPT sont discordants avec l'information génétique foetale qui a été rapportée. Cette étude sert de validation de principe pour le diagnostic prénatal non envahissant utilisant les cellules foetales de diffusion sans n'importe quelle purification stricte de cellules. »

La modification

Avec du Sc-ddPCR, chaque gouttelette est dans un puits et contient jusqu'à 3.000 cellules, qui s'analysent en même temps. La technique originelle donne des résultats très spécifiques et sensibles d'une cellule. L'édition est qu'à moins que la suspension de cellules ait un mouvement propre clair, cela ne fonctionne pas bien. Pour assurer ceci, les lignées cellulaires doivent être lavées, ou trier fluorescence-activé des cellules être exécutées.

La modification actuelle obvie à ce besoin en fournissant un meilleur environnement d'ACP dans la gouttelette, permettant une sensibilité et une spécificité plus élevées. Ceci permet pour évaluer l'information génétique d'une cellule basée sur un échantillon crûment épuré contenant les cellules nucléées.

Les chercheurs ont prélevé des prises de sang de 13 femmes enceintes et se sont concentrés sur employer une suspension crûment triée de cellules et les techniques Sc-ddPCR pour recenser l'ADN génomique d'un foetus mâle, des cellules foetales diffusant dans le sang de la mère. Ils ont constaté qu'ils ont réalisé la sensibilité élevée en déterminant la présence du SRY, ou sexe-déterminant le gène de Y, le lieu chromosomique qui règle le début de la détermination de sexe dans un mâle.

L'épreuve

En d'autres termes, ils ont constaté que le gène de SRY était présent seulement dans les échantillons obtenus à partir des femmes de 3/13 qui ont eu les foetus mâles. Ceci montre la sensibilité et la spécificité élevées du système Sc-ddPCR modifié.

Implications

Une fois que ces découvertes sont validées, en s'appliquant la technique à de plus grands numéros des prises de sang à partir des femmes enceintes en ce qui concerne d'autres gènes, elle pourrait être étendue à beaucoup d'autres zones d'application. Hata observe si tout va bien, « à l'avenir, en optimisant trier et encapsulation de cellules, ainsi que produisant d'un environnement plus efficace d'ACP dans chaque gouttelette, ce système Sc-ddPCR modifié peut être une méthode d'analyse de découverte qui peut être appliquée aux royaumes variés de recherches et probablement au test diagnostique clinique. »

Journal reference:

Direct Assessment of Single-Cell DNA Using Crudely Purified Live Cells: A Proof of Concept for Noninvasive Prenatal Definitive Diagnosis Sato, Taisuke et al. The Journal of Molecular Diagnostics, Volume 22, Issue 2, 132 - 140, https://jmd.amjpathol.org/article/S1525-1578(19)30431-3/fulltext

Dr. Liji Thomas

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Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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