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Analisi del sangue unicellulare prenatale per i difetti di gene

Con lo stato corrente di conoscenza per quanto riguarda test genetico, il test prenatale non invadente (NIPT) è nel favore per test genetico nei bambini futuri, facendo uso dei frammenti di DNA che circolano nel sangue della madre.

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L'elettroforesi di reazione a catena (PCR) e del gel di agarosio della polimerasi è un metodo di elettroforesi del gel utilizzato nella biochimica, nella biologia molecolare, nella genetica e nella chimica clinica in laboratorio. Credito: Rattiya Thongdumhyu/Shutterstock

Ora un nuovo NIPT è stato riferito nel giornale dei sistemi diagnostici molecolari nel febbraio 2020, che fornisce la prova che intera analisi unicellulare del DNA facendo uso delle celle fetali in tensione raramente di avvenimento nella circolazione materna, in base ad una tecnica modificata di PCR, ha l'alte sensibilità e specificità nel prendere le anomalie del DNA. Ciò migliora le probabilità di rilevazione delle anomalie genetiche fetali.

Schema del sistema digitale di PCR a gocciolina basata a unica (Sc-ddPCR). Facendo uso del sistema del ddPCR QX200, ogni cella è incapsulata semplicemente in una gocciolina. Fino a 3.000 celle per pozzo possono essere incapsulate determinato. Successivamente, la lisi delle cellule e la PCR con le sonde e le mani di fondo sono eseguite in ogni gocciolina. Per concludere, quantificando le goccioline fluorescenti, il DNA genomico unicellulare può essere valutato. B) Conferma di incapsulamento unicellulare dopo la generazione delle goccioline con una riga umana del linfocita B. Sinistra, nel campo luminoso; destra, con un filtro da Hoechst. C) Tracciato bidimensionale di ampiezza del segnale delle sonde SRY e RPP30 in ogni gocciolina individuata facendo uso del nostro sistema modificato Sc-ddPCR. Ampiezza del segnale delle sonde con 1× PBS come un controllo in bianco (sinistro), una riga femminile umana del linfocita B (HEV0230) come controllo negativo (medio) e riga maschio umana del linfocita B (HEV0057) come controllo positivo (destra). Credito: Giornale dei sistemi diagnostici molecolari
A) Schema del sistema digitale di PCR a gocciolina basata a unica (Sc-ddPCR). Facendo uso del sistema del ddPCR QX200, ogni cella è incapsulata semplicemente in una gocciolina. Fino a 3.000 celle per pozzo possono essere incapsulate determinato. Successivamente, la lisi delle cellule e la PCR con le sonde e le mani di fondo sono eseguite in ogni gocciolina. Per concludere, quantificando le goccioline fluorescenti, il DNA genomico unicellulare può essere valutato. B) Conferma di incapsulamento unicellulare dopo la generazione delle goccioline con una riga umana del linfocita B. Sinistra, nel campo luminoso; destra, con un filtro da Hoechst. C) Tracciato bidimensionale di ampiezza del segnale delle sonde SRY e RPP30 in ogni gocciolina individuata facendo uso del nostro sistema modificato Sc-ddPCR. Ampiezza del segnale delle sonde con 1× PBS come un controllo in bianco (sinistro), una riga femminile umana del linfocita B (HEV0230) come controllo negativo (medio) e riga maschio umana del linfocita B (HEV0057) come controllo positivo (destra). Credito: Giornale dei sistemi diagnostici molecolari

NIPTs - limitazioni

Contrariamente alle prove dilaganti gradisca l'amniocentesi che hanno il potenziale per danno fetale, il NIPTs in uso oggi presentano molti vantaggi compreso l'assenza di rischi fetali, ma egualmente presentano le loro limitazioni. Una delle imperfezioni principali è che a volte rendono i dati non utili perché esaminano i frammenti di DNA, rilasciati dalle celle fetali o placentari durante la loro ripartizione. Questi bit del DNA quindi sono chiamati DNA o cfDNA senza cellula, piuttosto che l'intero genoma. Ciò non permette sempre che l'analista sappia se il DNA venga dalle celle o dal feto della madre. Di conseguenza, NIPT è una prova di selezione e non un test diagnostico definitivo.

Gli scienziati sono sempre quindi sull'allerta affinchè migliore NIPTs facciano una determinazione conclusiva delle anomalie genetiche fetali. La maggior parte di queste tecniche dipendono dall'uso di cfDNA che circola nel sangue della madre superiore a 4 per cento. Le celle fetali nel sangue della madre sono estremamente raro dovuto l'alta efficacia della barriera placentare e questa posa una sfida ardua per l'analista. Per aumentare le probabilità di rilevazione del DNA fetale, molte prove usano la reazione a catena della polimerasi (PCR). Ciò è un metodo da cui un singolo campione di DNA è moltiplicato in milioni, originalmente progettati per il biochimico americano Kary Mullis, per cui ha ricevuto il premio Nobel.

La nuova tecnica

Lo studio corrente ha usato un modulo modificato della PCR digitale della gocciolina unicellulare (Sc-ddPCR). Facendo uso di alcuni adeguamenti alla tecnica di base, hanno redatto il proof of concept che questo può valutare il genoma delle celle fetali trovate dentro estremamente - concentrazioni basse nella circolazione materna, da un campione di sangue ricavato da un filone periferico. Ciò ha potuto piombo allo sviluppo di una prova per valutare il DNA di una cella vivente direttamente da sangue materno, evitante i punti della fissazione delle cellule, la macchiatura delle cellule e l'amplificazione di intero genoma.

Spiega il ricercatore Kenichiro Hata, “abbiamo osservato che i risultati di NIPT sono in alcuni casi divergenti con le informazioni genetiche fetali che sono state riferite. Questo studio servisce da proof of concept per la diagnosi prenatale non invadente facendo uso del fare circolare le celle fetali senza alcuna depurazione rigorosa delle cellule.„

La modifica

Con lo Sc-ddPCR, ogni gocciolina è in un pozzo e contiene fino a 3.000 celle, che sono analizzate allo stesso tempo. La tecnica originale dà i risultati molto specifici e sensibili da un unicellulare. L'emissione è che a meno che la sospensione delle cellule abbia un chiaro sfondo, non funziona bene. Per assicurare questo, le linee cellulari devono essere lavate, o ordinamento fluorescenza-attivato delle celle essere eseguite.

La modifica corrente previene questo bisogno fornendo un migliore ambiente di PCR all'interno della gocciolina, permettendo il più alte sensibilità e specificità. Ciò permette di valutare le informazioni genetiche da un unicellulare basato su un campione crudamente depurativo che contiene le celle nucleate.

I ricercatori hanno prelevato i campioni di sangue da 13 donne incinte ed hanno messo a fuoco sul usando una sospensione crudamente ordinata delle cellule e le tecniche Sc-ddPCR per identificare il DNA genomico di un feto maschio, dalle celle fetali che circolano nel sangue della madre. Hanno trovato che hanno raggiunto l'alta sensibilità nella determinazione della presenza dello SRY, o sesso-determinando il gene di Y, il luogo cromosomico che regolamenta l'inizio della determinazione del sesso in un maschio.

La prova

Cioè hanno trovato che il gene di SRY era presente soltanto nei campioni ottenuti dalle donne di 3/13 che hanno avute feti maschii. Ciò mostra l'alte sensibilità e specificità del sistema modificato Sc-ddPCR.

Implicazioni

Una volta che questi risultati sono convalidati, applicando la tecnica ad un gran numero di campioni di sangue dalle donne incinte riguardo ad altri geni, potrebbe essere estendere a molti altri campi di applicazione. Hata osserva eventualmente, “in futuro, ottimizzando l'ordinamento e l'incapsulamento delle cellule come pure generanti un ambiente più efficace di PCR in ogni gocciolina, questo sistema modificato Sc-ddPCR può essere un metodo di analisi dell'innovazione che può applicarsi ai vari regni della ricerca e possibilmente alla prova diagnostica clinica.„

Journal reference:

Direct Assessment of Single-Cell DNA Using Crudely Purified Live Cells: A Proof of Concept for Noninvasive Prenatal Definitive Diagnosis Sato, Taisuke et al. The Journal of Molecular Diagnostics, Volume 22, Issue 2, 132 - 140, https://jmd.amjpathol.org/article/S1525-1578(19)30431-3/fulltext

Dr. Liji Thomas

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Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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