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Única análise de sangue pré-natal da pilha para defeitos de gene

Com o estado actual de conhecimento em relação ao teste genético, o teste pré-natal não invasor (NIPT) está no favor para o teste genético em bebês por nascer, usando os fragmentos do ADN que circulam no sangue da matriz.

A electroforese do gel da reacção em cadeia e do Agarose da polimerase é um método da electroforese do gel usado na bioquímica, na biologia molecular, na genética, e na química clínica no laboratório. Crédito: Rattiya Thongdumhyu/Shutterstock
A electroforese do gel (PCR) da reacção em cadeia e do Agarose da polimerase é um método da electroforese do gel usado na bioquímica, na biologia molecular, na genética, e na química clínica no laboratório. Crédito: Rattiya Thongdumhyu/Shutterstock

Um NIPT novo tem sido relatado agora no jornal de diagnósticos moleculars em fevereiro de 2020, que fornece a evidência que análise inteira do ADN da única pilha usando pilhas fetal vivas raramente de ocorrência na circulação materna, com base em uma técnica alterada do PCR, tem a sensibilidade e a especificidade altas em pegarar anomalias do ADN. Isto aumenta as possibilidades de detectar anomalias genéticas fetal.

Esquema do sistema digital único-pilha-baseado do PCR da gota (sc-ddPCR). Usando o sistema do ddPCR QX200, cada pilha é encapsulada simplesmente em uma gota. Até 3.000 pilhas pelo poço podem individualmente ser encapsuladas. Subseqüentemente, o lysis da pilha e o PCR com pontas de prova e primeiras demão são executados em cada gota. Finalmente, determinando as gotas fluorescentes, o ADN genomic da único-pilha pode ser avaliado. B) Confirmação da capsulagem da único-pilha após ter gerado gotas com uma linha humana da B-pilha. Esquerda, no campo brilhante; direito, com um filtro de Hoechst. C) Lote bidimensional da amplitude do sinal das pontas de prova SRY e RPP30 em cada gota detectada usar nosso sistema sc-ddPCR alterado. Amplitude do sinal das pontas de prova com 1× PBS como um controle vazio (esquerdo), uma linha fêmea humana da B-pilha (HEV0230) como um controle negativo (médio), e uma linha masculina humana da B-pilha (HEV0057) como um controle positivo (direito). Crédito: Jornal de diagnósticos moleculars
A) Esquema do sistema digital único-pilha-baseado do PCR da gota (sc-ddPCR). Usando o sistema do ddPCR QX200, cada pilha é encapsulada simplesmente em uma gota. Até 3.000 pilhas pelo poço podem individualmente ser encapsuladas. Subseqüentemente, o lysis da pilha e o PCR com pontas de prova e primeiras demão são executados em cada gota. Finalmente, determinando as gotas fluorescentes, o ADN genomic da único-pilha pode ser avaliado. B) Confirmação da capsulagem da único-pilha após ter gerado gotas com uma linha humana da B-pilha. Esquerda, no campo brilhante; direito, com um filtro de Hoechst. C) Lote bidimensional da amplitude do sinal das pontas de prova SRY e RPP30 em cada gota detectada usar nosso sistema sc-ddPCR alterado. Amplitude do sinal das pontas de prova com 1× PBS como um controle vazio (esquerdo), uma linha fêmea humana da B-pilha (HEV0230) como um controle negativo (médio), e uma linha masculina humana da B-pilha (HEV0057) como um controle positivo (direito). Crédito: Jornal de diagnósticos moleculars

NIPTs - limitações

Em contraste com os testes invasores goste da amniocentese que têm o potencial para o dano fetal, o NIPTs no uso têm hoje muitas vantagens incluir a ausência de riscos fetal, mas igualmente têm suas limitações. Um dos defeitos principais é que rendem às vezes dados não-úteis porque examinam os fragmentos do ADN, liberados das pilhas fetal ou placental durante sua divisão. Estes bits do ADN são chamados conseqüentemente ADN ou cfDNA sem célula, um pouco do que o genoma inteiro. Isto não permite sempre que o analista saiba se o ADN vem das pilhas ou do feto de matriz. Em conseqüência, NIPT é um teste de selecção e não um teste de diagnóstico definitivo.

Os cientistas estão conseqüentemente sempre na vigia para que melhor NIPTs faça uma determinação conclusiva de anomalias genéticas fetal. A maioria destas técnicas dependem do uso do cfDNA que circula no sangue da matriz acima de 4 por cento. As pilhas Fetal no sangue da matriz são extremamente raro devido à eficácia alta da barreira placental, e esta levanta um desafio formidável ao analista. Para aumentar as possibilidades da detecção do ADN fetal, muitos testes utilizam a reacção em cadeia da polimerase (PCR). Este é um método por que uma única amostra de ADN é multiplicada em milhões, projetados originalmente pelo bioquímico americano Kary Mullis, para que foi concedido o prémio nobel.

A técnica nova

O estudo actual usou um formulário alterado do PCR digital da única gota da pilha (sc-ddPCR). Usando alguns ajustes à técnica básica, produziram a prova de conceito que este pode avaliar o genoma das pilhas fetal encontradas dentro extremamente - baixas concentrações na circulação materna, de uma amostra de sangue seleccionada de uma veia periférica. Isto podia conduzir à revelação de um teste para avaliar o ADN de uma pilha viva directamente do sangue materno, evitando as etapas da fixação da pilha, a mancha da pilha e a amplificação do genoma inteiro.

Explica o pesquisador Kenichiro Hata, “nós observamos que em alguns casos os resultados de NIPT são discordantes com a informação genética fetal que foi relatada. Este estudo serve como uma prova de conceito para o diagnóstico pré-natal não invasor usando pilhas fetal de circulação sem nenhuma purificação restrita da pilha.”

A alteração

Com o sc-ddPCR, cada gota está em um poço e contem até 3.000 pilhas, que são analisadas ao mesmo tempo. A técnica original rende resultados muito específicos e sensíveis de uma única pilha. A edição é que a menos que a suspensão da pilha tiver um fundo claro, não trabalha bem. Para assegurar isto, as linha celular devem ser lavadas, ou classificação fluorescência-ativada das pilhas ser executadas.

A alteração actual previne esta necessidade fornecendo um ambiente melhor do PCR dentro da gota, permitindo uma sensibilidade e uma especificidade mais altas. Isto torna possível avaliar a informação genética de uma única pilha baseada em uma amostra bruta refinada que contem pilhas nucleated.

Os pesquisadores tomaram amostras de sangue de 13 mulheres gravidas e centraram-se sobre a utilização de uma suspensão bruta classificada da pilha e das técnicas sc-ddPCR para identificar o ADN genomic de um feto masculino, das pilhas fetal que circulam no sangue da matriz. Encontraram que conseguiram a sensibilidade alta em determinar a presença do SRY, ou sexo-determinando o gene de Y, o locus cromossomático que regula o começo da determinação de sexo em um homem.

A prova

Ou seja encontraram que o gene de SRY estou presente somente nas amostras obtidas das mulheres de 3/13 que tiveram os feto masculinos. Isto mostra a sensibilidade e a especificidade altas do sistema sc-ddPCR alterado.

Implicações

Uma vez que estes resultados são validados, aplicando a técnica aos números maiores de amostras de sangue das mulheres gravidas no que diz respeito a outros genes, poderia ser estendida a muitas outras áreas da aplicação. Hata observa esperançosamente, “no futuro, aperfeiçoando a classificação e a capsulagem da pilha, assim como gerando um ambiente mais eficaz do PCR em cada gota, este sistema sc-ddPCR alterado pode ser um método de análise da descoberta que possa ser aplicado aos vários reinos da pesquisa e possivelmente ao teste diagnóstico clínico.”

Journal reference:

Direct Assessment of Single-Cell DNA Using Crudely Purified Live Cells: A Proof of Concept for Noninvasive Prenatal Definitive Diagnosis Sato, Taisuke et al. The Journal of Molecular Diagnostics, Volume 22, Issue 2, 132 - 140, https://jmd.amjpathol.org/article/S1525-1578(19)30431-3/fulltext

Dr. Liji Thomas

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Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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