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Análisis de sangre unicelular prenatal para los defectos de gen

Con el estado actual del conocimiento con respecto a pruebas genéticas, la prueba prenatal no invasor (NIPT) está en el favor para las pruebas genéticas en bebés nonatos, usando los fragmentos de la DNA que circulan en la sangre del molde-madre.

La electroforesis del gel de la reacción en y de la agarosa cadena de polimerasa es un método de electroforesis del gel usado en bioquímica, biología molecular, genética, y química clínica en laboratorio. Haber: Rattiya Thongdumhyu/Shutterstock
La electroforesis del gel de la reacción en (PCR) y de la agarosa cadena de polimerasa es un método de electroforesis del gel usado en bioquímica, biología molecular, genética, y química clínica en laboratorio. Haber: Rattiya Thongdumhyu/Shutterstock

Ahora un nuevo NIPT se ha denunciado en el gorrón de diagnósticos moleculares en febrero de 2020, que proporciona pruebas que el análisis entero unicelular de la DNA usando las células fetales vivas raramente de ocurrencia en la circulación maternal, sobre la base de una técnica modificada de la polimerización en cadena, tiene altas sensibilidad y especificidad en tomar anormalidades de la DNA. Esto aumenta las ocasiones de descubrir anomalías genéticas fetales.

Esquema del sistema digital único-célula-basado de la polimerización en cadena de la gotita (sc-ddPCR). Usando el sistema del ddPCR QX200, cada célula se encapsula simple en una gotita. Hasta 3.000 células por pozo pueden ser encapsuladas individualmente. Posteriormente, la lisis de la célula y la polimerización en cadena con las antenas y las pinturas de fondo se realizan en cada gotita. Finalmente, cuantificando las gotitas fluorescentes, la DNA genomic unicelular puede ser fijado. B) Confirmación de la encapsulación unicelular después de generar gotitas con una línea humana del linfocito B. Izquierda, en campo brillante; la derecha, con un filtro de Hoechst. C) Gráfico bidimensional de la amplitud de la señal de las antenas SRY y RPP30 en cada gotita descubierta usando nuestro sistema modificado sc-ddPCR. Amplitud de la señal de antenas con 1× PBS como un mando en blanco (izquierdo), una línea femenina humana del linfocito B (HEV0230) como mando negativo (central), y línea masculina del linfocito B del ser humano (HEV0057) como mando positivo (correcto). Haber: Gorrón de diagnósticos moleculares
A) Esquema del sistema digital único-célula-basado de la polimerización en cadena de la gotita (sc-ddPCR). Usando el sistema del ddPCR QX200, cada célula se encapsula simple en una gotita. Hasta 3.000 células por pozo pueden ser encapsuladas individualmente. Posteriormente, la lisis de la célula y la polimerización en cadena con las antenas y las pinturas de fondo se realizan en cada gotita. Finalmente, cuantificando las gotitas fluorescentes, la DNA genomic unicelular puede ser fijado. B) Confirmación de la encapsulación unicelular después de generar gotitas con una línea humana del linfocito B. Izquierda, en campo brillante; la derecha, con un filtro de Hoechst. C) Gráfico bidimensional de la amplitud de la señal de las antenas SRY y RPP30 en cada gotita descubierta usando nuestro sistema modificado sc-ddPCR. Amplitud de la señal de antenas con 1× PBS como un mando en blanco (izquierdo), una línea femenina humana del linfocito B (HEV0230) como mando negativo (central), y línea masculina del linfocito B del ser humano (HEV0057) como mando positivo (correcto). Haber: Gorrón de diagnósticos moleculares

NIPTs - limitaciones

En contraste con las pruebas invasores tenga gusto de la amniocentesis que tienen el potencial para el daño fetal, el NIPTs que el hoy funcionando tiene muchas ventajas incluyendo la ausencia de riesgos fetales, pero también tienen sus limitaciones. Uno de los defectos mayores es que rinden a veces datos no-útiles porque examinan los fragmentos de la DNA, liberados de las células fetales o placentarias durante su avería. Estas brocas de la DNA por lo tanto se llaman DNA o cfDNA sin células, bastante que el genoma entero. Esto no permite siempre que el analista sepa si la DNA venga del feto de molde-madre de las células o. Como consecuencia, NIPT es una prueba de cribado y no una prueba diagnóstica definitiva.

Los científicos están por lo tanto siempre en el puesto de observación para que un mejor NIPTs haga una determinación concluyente de anormalidades genéticas fetales. La mayor parte de estas técnicas dependen del uso del cfDNA que circula en la sangre del molde-madre en encima del 4 por ciento. Las células fetales en la sangre del molde-madre son extremadamente raro debido a la alta eficacia de la barrera placentaria, y ésta plantea un reto formidable al analista. Para aumentar las ocasiones de la detección de la DNA fetal, muchas pruebas hacen uso de la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Éste es un método por el cual una única muestra de la DNA es multiplicada en millones, diseñados originalmente por el bioquímico americano Kary Mullis, para quien le concedieron el Premio Nobel.

La nueva técnica

El estudio actual utilizó una forma modificada de la polimerización en cadena digital de la gotita unicelular (sc-ddPCR). Usando algunos ajustes en la técnica básica, produjeron la prueba del concepto que éste puede evaluar el genoma de las células fetales encontradas hacia adentro extremadamente - las concentraciones inferiores en la circulación maternal, de una muestra de sangre extraída de una vena periférica. Esto podía llevar al revelado de una prueba para fijar la DNA de una célula viva directamente de la sangre maternal, evitando los pasos de la fijación de la célula, la coloración de la célula y la amplificación del genoma entero.

Explica al investigador Kenichiro Hata, “hemos observado que los resultados de NIPT están en algunos casos discordes con la información genética fetal se ha denunciado que. Este estudio sirve como prueba del concepto para la diagnosis prenatal no invasor usando la circulación de las células fetales sin ninguna purificación estricta de la célula.”

La modificación

Con el sc-ddPCR, cada gotita está en un pozo y contiene hasta 3.000 células, que se analizan al mismo tiempo. La técnica original rinde resultados muy específicos y sensibles de una célula. La entrega es que a menos que la suspensión de la célula tenga un fondo sin obstrucción, no trabaja bien. Para asegurar esto, las variedades de células deben ser lavadas, o clasificación fluorescencia-activada de las células ser realizadas.

La modificación actual evita esta necesidad ofreciendo un mejor ambiente de la polimerización en cadena dentro de la gotita, permitiendo una sensibilidad y una especificidad más altas. Esto permite evaluar la información genética de una célula basada en una muestra crudamente purificada que contiene las células nucleated.

Los investigadores recogieron muestras de sangre a partir de 13 mujeres embarazadas y se centraron en usar una suspensión crudamente clasificación de la célula y las técnicas sc-ddPCR para determinar la DNA genomic de un feto masculino, de las células fetales que circulaban en la sangre del molde-madre. Encontraron que lograron alta sensibilidad en la determinación de la presencia del SRY, o sexo-determinando el gen de Y, el lugar geométrico cromosómico que regula el principio de la determinación de sexo en un varón.

La prueba

Es decir encontraron que el gen de SRY estaba presente solamente en las muestras obtenidas de las mujeres de 3/13 que tenían fetos masculinos. Esto muestra la altas sensibilidad y especificidad del sistema modificado sc-ddPCR.

Implicaciones

Una vez que se validan estas conclusión, aplicando la técnica a números más grandes de muestras de sangre de mujeres embarazadas en cuanto a otros genes, podría ser ampliada a muchas otras áreas del uso. Hata observa esperanzadamente, “en el futuro, optimizando la clasificación y la encapsulación de la célula, así como generando un ambiente más efectivo de la polimerización en cadena en cada gotita, este sistema modificado sc-ddPCR puede ser un método de análisis de la ruptura que se puede aplicar a los diversos reinos de la investigación y posiblemente a la prueba diagnóstica clínica.”

Journal reference:

Direct Assessment of Single-Cell DNA Using Crudely Purified Live Cells: A Proof of Concept for Noninvasive Prenatal Definitive Diagnosis Sato, Taisuke et al. The Journal of Molecular Diagnostics, Volume 22, Issue 2, 132 - 140, https://jmd.amjpathol.org/article/S1525-1578(19)30431-3/fulltext

Dr. Liji Thomas

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Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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