Minigenes a produit par affection hépatique de combat de CRISPR chez les souris

Une technique neuve de gène-retouche basée sur CRISPR a été employée pour éviter avec succès le développement d'une affection hépatique qui peut être provoquée par des centaines de mutations, ainsi que pour soulager les sympt40mes chez les souris. Cette étude d'épreuve-de-concept était publiée en ligne dans les avances de la Science de tourillon en février 2020.

Le mouvement propre

La technique de CRISPR est une modification d'une méthode précédente développée par des chercheurs à la même institution pour éliminer juste une anomalie génétique. Les chercheurs ont adapté la méthode originelle pour rectifier l'état génétique provoqué par le déficit du transcarbamylase principal d'ornithine d'enzymes (OTC).

3D rendant la retouche de Crispr ADN. Crédit d
3D rendant la retouche de Crispr ADN. Crédit d'image : Nathan Devery/Shutterstock

Le déficit d'OTC se produit dans environ 1 dans 40.000 vivants portés par bébés et peut être dû à plus de 300 mutations différentes sur le gène d'OTC, situé sur le chromosome X. L'OTC est essentiel pour le fonctionnement normal du cycle d'urée.

Le cycle d'urée est une enzyme 6 de processus qui convertit l'ammoniaque toxique en moins d'urée toxique. Une défectuosité en l'un de ces enzymes a comme conséquence l'habillage de l'ammoniaque dans le sang, et de là au cerveau. Cette toxine endommage les cellules nerveuses sensibles du cerveau et peut même tuer le patient.

Puisque le chromosome X est présent dans seulement une copie unique dans les mâles, la défectuosité devient évidente à la naissance, en grande partie dans les mâles. Les femelles ont 2 chromosomes de X, ainsi à moins que les deux transportent une défectuosité sur ce gène, la condition n'est pas cliniquement manifestée. Au lieu de cela, la femelle avec une défectuosité sur seulement une de ses deux gènes d'OTC devient un transporteur et peut transmettre la défectuosité à la moitié de sa progéniture potentielle. D'autres mutations sur le même gène produisent de diverses autres conditions génétiques.

L'étude

Le traitement précoce est essentiel dans la plupart des affections génétiques à cause de l'expression typique tôt de l'anomalie, qui peut gêner le développement normal. Les traitements actuels se concentrent sur libérer à l'extérieur l'ammoniaque par d'autres voies qui sont stimulées par des médicaments. Si la défectuosité est très sévère, une greffe de foie peut être exigée. D'autre part, un trop grand nombre de ces patients meurent, et les cliniciens qui voient cette condition souvent recherchent soutenu des demandes de règlement améliorées.

La technique

La technique plus tôt était trop spécifique pour traiter cette maladie dans laquelle l'un des plus de 300 mutations pourrait être présent. Par conséquent, l'équipe s'est concentrée sur concevoir un éditeur de génome avec un champ d'application plus grand. Ceci est basé sur l'introduction d'un minigene, ou un ensemble de directives de protéine-codage, dans les cellules de foie, par un vecteur viral appelé un virus adeno-associé (AAV). Le minigene ne modifie pas la pièce défectueuse du gène mais ajoute un jeu d'instructions neuf par une approche de type de « couper-coller ».

Pour ceci, ils ont établi la première fois un double vecteur personnalisé d'AAV qui a contenu Cas9, une protéine bactérienne qui est guidée par l'ARN pour recenser et éditer des gènes dans des cellules rapidement. Ce vecteur neuf est AAV8 appelé, et il émigre expressément vers les cellules de foie. Le deuxième AAV a un minigene qui contient le donneur ADN codant l'enzyme humaine d'OTC. Ce minigene fonctionnel est réglé par une séquence de promoteur qui est spécifique aux cellules de foie. Cette sauvegarde s'assure qu'elle sera exprimée seulement dans des cellules de foie après avoir été injecté dans le sang par l'intermédiaire de l'AAV.

Le Cas9 premier entaille le brin d'ADN au site d'objectif dans la séquence du gène. C'est la pièce de « coupure » du procédé et est suivie de la « pâte, » où le minigene est ajouté par l'intermédiaire d'un réglage homologie-dirigé appelé de processus de réparation.

L'ajout a permis aux souris nouveau-nées de se développer d'une façon beaucoup plus saine. À trois semaines de durée, 25% des cellules de foie exprimaient l'OTC, et à 8 semaines, 35% montraient cette expression. Ceci peut sembler comme une différence modeste, mais est toujours trois et quatre fois l'effet a produit en employant le vecteur untargeted à ces remarques de temps, respectivement.

Quand le foie a été examiné à ces remarques de temps, les chercheurs ont trouvé des boîtiers des cellules productrices d'OTC situées dans tout le foie plus ou moins uniformément. La différence a persisté dans la vie adulte. Même à un régime à haute valeur protéique, les souris visées ont montré à des niveaux d'ammoniaque 60% plus bas que dans les souris non traitées.

Les implications

La différence est expliquée par un autre chercheur, Lili Wang : « À la différence d'autres approches de CRISPR qui effacent ou modifient une partie du gène normal, cette technique intègre une partie neuve. Nous n'essayons pas de rectifier les mutations qui arrêtent des cellules de foie de produire l'OTC ; nous ajoutons ce minigene neuf ainsi les cellules mettent en boîte. »

L'étude prouve que cette technique basée sur CRISPR neuve peut être adaptée pour éviter les manifestations cliniques d'un état génétique rare provoqué par des mutations multiples. Elle pourrait également être employée pour alléger d'autres conditions héréditaires provoquées par d'autres mutations du même gène. La caractéristique critique de cette approche est qu'elle emploie une stratégie pour combattre une condition provoquée par un certain nombre de mutations à différentes parties du génome, et pas simplement une mutation en chef.

Le chercheur James Wilson explique : « Ici, nous avons fait avancer une approche de CRISPR pour supporter non seulement l'expression de l'OTC dans les cellules mais pour élargir également les capacités de l'outil. Nous nous sommes rapprochés une approche potentielle de gène-retouche « de spectre grand » pour soigner des patients avec le déficit d'OTC, indépendamment de la mutation et de l'état clinique. La prochaine opération, par des études précliniques complémentaires, est de trouver un site de règle d'exonération sur le gène en cellules de foie humaines et puis de vérifier une approche assimilée de gène-retouche. »

Journal reference:

A mutation-independent CRISPR-Cas9–mediated gene targeting approach to treat a murine model of ornithine transcarbamylase deficiency, Lili Wang, Yang Yang, Camilo Breton, Peter Bell1, Mingyao Li, Jia Zhang, Yan Che, Alexei Saveliev, Zhenning He, John White, Caitlin Latshaw, Chenyu Xu, Deirdre McMenamin, Hongwei Yu, Hiroki Morizono, Mark L. Batshaw and James M. Wilson, Science Advances 12 Feb 2020, Vol. 6, no. 7, eaax5701, DOI: 10.1126/sciadv.aax5701

Dr. Liji Thomas

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Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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