Minigenes ha prodotto dall'affezione epatica di combattimento di CRISPR in mouse

Una nuova tecnica gene-modificante basata su CRISPR è stata usata per evitare con successo lo sviluppo di un'affezione epatica che può essere causata dalle centinaia di mutazioni come pure per facilitare i sintomi in mouse. Questo studio del proof of concept è stato pubblicato online negli avanzamenti di scienza del giornale nel febbraio 2020.

I precedenti

La tecnica di CRISPR è una modifica di un metodo precedente messo a punto dai ricercatori alla stessa istituzione per eliminare appena un difetto genetico. I ricercatori hanno adattato il metodo originale per correggere lo stato genetico causato dalla carenza delle transcarbamilasi chiave dell'ornitina degli enzimi (OTC).

3D che rende modificare del DNA di Crispr. Credito di immagine: Nathan Devery/Shutterstock
3D che rende modificare del DNA di Crispr. Credito di immagine: Nathan Devery/Shutterstock

La carenza di OTC si presenta in circa 1 in 40.000 vivi sopportati bambini e può essere dovuto oltre 300 mutazioni differenti sul gene di OTC, situato sul cromosoma X. OTC è essenziale per il funzionamento normale del ciclo dell'urea.

Il ciclo dell'urea è un enzima 6 trattato che converte l'ammoniaca tossica in meno urea tossica. Un difetto in qualcuno di questi enzimi provoca l'accumulazione di ammoniaca nel sangue e di là al cervello. Questa tossina danneggia le cellule nervose sensibili del cervello e può anche uccidere il paziente.

Poiché il cromosoma X è presente soltanto in una singola copia in maschi, il difetto diventa evidente alla nascita, principalmente in maschi. Le femmine hanno 2 cromosomi X, in modo da a meno che entrambe portino un difetto su questo gene, la circostanza non è manifestata clinicamente. Invece, la femmina con un difetto su soltanto uno dei suoi due geni di OTC diventa i portafili e può passare sopra il difetto alla metà della sua prole potenziale. Altre mutazioni sullo stesso gene producono le varie circostanze genetiche.

Lo studio

Il trattamento iniziale è essenziale nella maggior parte delle malattie genetiche a causa dell'espressione tipico iniziale dell'anomalia, che può ostacolare lo sviluppo normale. Le terapie correnti mettono a fuoco sul cambiare aria l'ammoniaca da altre vie che sono stimolate dalle medicine. Se il difetto è molto severo, un trapianto del fegato può essere richiesto. D'altra parte, troppi di questi pazienti muoiono ed i clinici che vedono questa circostanza stanno cercando spesso continuamente i trattamenti migliori.

La tecnica

La tecnica più iniziale era troppo specifica per trattare questa malattia in cui c'è ne del oltre 300 mutazioni potrebbero essere presenti. Di conseguenza, il gruppo ha messo a fuoco sulla progettazione dell'editore del genoma con un più vasto campo dell'applicazione. Ciò è basata sull'introduzione di un minigene, o su un insieme delle istruzioni della proteina-codifica, nelle celle di fegato, da un vettore virale chiamato un virus adeno-associato (AAV). Il minigene non altera il pezzo difettoso del gene ma aggiunge un nuovo insieme delle istruzioni da un tipo approccio “di taglia incolla„.

Per questo, in primo luogo hanno sviluppato un vettore doppio su misura di AAV che ha contenuto Cas9, una proteina batterica che è guidata da RNA per identificare rapido e modificare i geni all'interno delle celle. Questo nuovo vettore è chiamato AAV8 e migra esplicitamente verso le celle di fegato. Il secondo AAV ha un minigene che contiene il DNA del donatore che codifica l'enzima umano di OTC. Questo minigene funzionale è regolamentato da una sequenza del promotore che è specifica alle celle di fegato. Questa salvaguardia assicura che sia espressa soltanto all'interno delle celle di fegato dopo l'iniezione nel sangue via il AAV.

Il Cas9 primo scalfisce il filo del DNA al sito dell'obiettivo all'interno della sequenza del gene. Ciò è la parte “del taglio„ del trattamento ed è seguita “dall'inserimento,„ dove il minigene si aggiunge via un processo di riparazione chiamato la riparazione omologia-diretta.

L'aggiunta ha permesso che i mouse neonati si sviluppassero in un modo molto più sano. A tre settimane di vita, 25% delle celle di fegato stavano esprimendo OTC ed a 8 settimane, 35% stavano mostrando questa espressione. Ciò può sembrare come una differenza modesta, ma è ancora tre e quattro volte l'effetto ha prodotto mediante l'uso del vettore untargeted a questi punti di tempo, rispettivamente.

Quando il fegato è stato esaminato a questi punti di tempo, i ricercatori hanno trovato i cluster delle celle producenti OTC situate in tutto il fegato più o meno costante. La differenza ha persistito in vita adulta. Anche su una dieta altamente proteica, i mouse mirati a hanno mostrato a Livelli dell'ammoniaca 60% più in basso di in mouse non trattati.

Le implicazioni

La differenza è spiegata da un altro ricercatore, Lili Wang: “A differenza di altri approcci di CRISPR che cancellano o modificano una parte del gene normale, questa tecnica integra una nuova parte. Non stiamo provando a correggere le mutazioni che fermano le celle di fegato dalla produzione dell'OTC; stiamo aggiungendo questo nuovo minigene in modo dalle celle inscatolano.„

Lo studio indica che questa nuova a tecnica basata CRISPR può adattarsi per impedire le manifestazioni cliniche di uno stato genetico raro causato dalle mutazioni multiple. Potrebbe anche essere usato per alleviare altre circostanze ereditarie causate da altre mutazioni dello stesso gene. La funzionalità critica di questo approccio è che usa una strategia per combattere una circostanza causata da una serie di mutazioni alle parti differenti del genoma e non appena una mutazione principale.

Il ricercatore James Wilson spiega: “Qui, abbiamo mosso un approccio di CRISPR in avanti non solo per sostenere l'espressione di OTC nelle celle ma anche per estendere le abilità dello strumento. Ci siamo mossi più vicino “ad un vasto spettro„ potenziale chemodifichiamo l'approccio ai pazienti dell'ossequio con la carenza di OTC, indipendentemente dalla mutazione e dallo stato clinico. Il punto seguente, con gli studi preclinici supplementari, è di trovare un sito del porto sicuro sul gene in celle di fegato umane e poi di verificare un simile approccio gene-modificante.„

Journal reference:

A mutation-independent CRISPR-Cas9–mediated gene targeting approach to treat a murine model of ornithine transcarbamylase deficiency, Lili Wang, Yang Yang, Camilo Breton, Peter Bell1, Mingyao Li, Jia Zhang, Yan Che, Alexei Saveliev, Zhenning He, John White, Caitlin Latshaw, Chenyu Xu, Deirdre McMenamin, Hongwei Yu, Hiroki Morizono, Mark L. Batshaw and James M. Wilson, Science Advances 12 Feb 2020, Vol. 6, no. 7, eaax5701, DOI: 10.1126/sciadv.aax5701

Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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