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Minigenes produziu pela infecção hepática do combate de CRISPR nos ratos

Uma técnica deedição nova baseada em CRISPR foi usada para evitar com sucesso a revelação de uma infecção hepática que pudesse ser causada por centenas de mutações, assim como para facilitar os sintomas nos ratos. Este estudo do prova--conceito foi publicado em linha nos avanços da ciência do jornal em fevereiro de 2020.

O fundo

A técnica de CRISPR é uma alteração de um método precedente desenvolvido por pesquisadores na mesma instituição para eliminar apenas um defeito genético. Os pesquisadores adaptaram o método original para corrigir a condição genética causada pela deficiência do transcarbamylase chave do ornithine da enzima (OTC).

3D que rende a edição do ADN de Crispr. Crédito de imagem: Nathan Devery/Shutterstock
3D que rende a edição do ADN de Crispr. Crédito de imagem: Nathan Devery/Shutterstock

A deficiência do OTC ocorre em aproximadamente 1 em 40.000 vivos carregados bebês e pode ser devido sobre a 300 mutações diferentes no gene do OTC, situado no cromossoma de X. O OTC é essencial para o funcionamento normal do ciclo da uréia.

O ciclo da uréia é um processo de 6 enzimas que converta a amônia tóxica em menos uréia tóxica. Um defeito em qualqueras um enzimas conduz ao acúmulo da amônia no sangue, e dali ao cérebro. Esta toxina causa dano às pilhas de nervo sensíveis do cérebro e pode mesmo matar o paciente.

Desde que o cromossoma de X esta presente somente em uma única cópia nos homens, o defeito torna-se evidente no nascimento, na maior parte nos homens. As fêmeas têm 2 cromossomas de X, assim que a menos que ambos levarem um defeito neste gene, a circunstância não é manifestada clìnica. Em lugar de, a fêmea com um defeito em somente um de seus dois genes do OTC transforma-se um portador e pode-se passar sobre o defeito à metade de sua prole potencial. Outras mutações no mesmo gene produzem várias circunstâncias genéticas.

O estudo

O tratamento adiantado é essencial na maioria de desordens genéticas devido à expressão tipicamente adiantada da anomalia, que pode impedir a revelação normal. As terapias actuais centram-se sobre o cancelamento para fora da amônia por outros caminhos que são estimulados por medicinas. Se o defeito é muito severo, uma transplantação do fígado pode ser exigida. Por outro lado, demasiados destes pacientes morrem, e os clínicos que vêem esta circunstância frequentemente estão procurando continuamente tratamentos melhorados.

A técnica

A técnica mais adiantada era demasiado específica tratar esta doença em que algum do sobre 300 mutações pôde esta presente. Conseqüentemente, a equipe centrou-se sobre o projecto de um editor do genoma com um campo de aplicação mais largo. Isto é baseado na introdução de um minigene, ou em um grupo de instruções da proteína-codificação, nas pilhas de fígado, por um vector viral chamado um vírus adeno-associado (AAV). O minigene não altera a peça defeituosa do gene mas adiciona um grupo novo de instruções por um tipo aproximação do “cortado e colado”.

Para isto, construíram primeiramente um vector duplo personalizado de AAV que contivesse Cas9, uma proteína bacteriana que fosse guiada pelo RNA para identificar ràpida e editar genes dentro das pilhas. Este vector novo é chamado AAV8, e migra explicitamente para as pilhas de fígado. O segundo AAV tem um minigene que contenha o ADN do doador que codifica a enzima humana do OTC. Este minigene funcional é regulado por uma seqüência do promotor que seja específica às pilhas de fígado. Esta protecção assegura-se de que esteja expressada somente dentro das pilhas de fígado após a injecção no sangue através do AAV.

O Cas9 primeiro entalha a costa do ADN no local do alvo dentro da seqüência do gene. Esta é a peça do “corte” do processo e é seguida pela “pasta,” onde o minigene é adicionado através de um processo do reparo chamado reparo homologia-dirigido.

A adição permitiu que os ratos recém-nascidos tornassem-se em uma maneira muito mais saudável. Em três semanas da vida, 25% das pilhas de fígado expressavam o OTC, e em 8 semanas, 35% mostravam esta expressão. Isto pode parecer como uma diferença modesta, mas é ainda três e quatro vezes o efeito produziu pelo uso do vector untargeted nestes pontos do tempo, respectivamente.

Quando o fígado foi examinado nestes pontos do tempo, os pesquisadores encontraram conjuntos de pilhas deprodução situadas durante todo o fígado mais ou menos uniformemente. A diferença persistiu na vida adulta. Mesmo em uma dieta da alto-proteína, os ratos visados mostraram a níveis da amônia 60% mais baixo do que em ratos não tratados.

As implicações

A diferença é explicada por um outro pesquisador, Lili Wang: “Ao contrário de outras aproximações de CRISPR que suprimem ou alteram de uma parcela do gene normal, esta técnica integra uma parcela nova. Nós não estamos tentando corrigir as mutações que param pilhas de fígado de produzir o OTC; nós estamos adicionando este minigene novo assim que as pilhas enlatam.”

O estudo mostra que esta técnica CRISPR-baseada nova pode ser adaptada para impedir as manifestações clínicas de uma condição genética rara causada por mutações múltiplas. Poderia igualmente ser usado para aliviar outras circunstâncias hereditárias causadas por outras mutações do mesmo gene. A característica crítica desta aproximação é que usa uma estratégia para combater uma circunstância causada por um número de mutações em partes diferentes do genoma, e não apenas uma mutação principal.

O pesquisador James Wilson explica: “Aqui, nós movemos uma aproximação de CRISPR para a frente para sustentar não somente a expressão do OTC nas pilhas mas para alargar igualmente as capacidades da ferramenta. Nós movemo-nos mais perto “de um espectro largo potencial” queeditamos a aproximação para tratar pacientes com a deficiência do OTC, independentemente da mutação e do estado clínico. O passo seguinte, com os estudos pré-clínicos adicionais, é encontrar um local do porto seguro no gene em pilhas de fígado humanas e testar então uma aproximação deedição similar.”

Journal reference:

A mutation-independent CRISPR-Cas9–mediated gene targeting approach to treat a murine model of ornithine transcarbamylase deficiency, Lili Wang, Yang Yang, Camilo Breton, Peter Bell1, Mingyao Li, Jia Zhang, Yan Che, Alexei Saveliev, Zhenning He, John White, Caitlin Latshaw, Chenyu Xu, Deirdre McMenamin, Hongwei Yu, Hiroki Morizono, Mark L. Batshaw and James M. Wilson, Science Advances 12 Feb 2020, Vol. 6, no. 7, eaax5701, DOI: 10.1126/sciadv.aax5701

Dr. Liji Thomas

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Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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