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Minigenes produjo por enfermedad del higado del combate de CRISPR en ratones

Una nueva técnica gen-que corregía basada en CRISPR fue utilizada para evitar con éxito el revelado de una enfermedad del higado que se puede causar por centenares de mutaciones, así como para facilitar los síntomas en ratones. Este estudio del prueba-de-concepto fue publicado en línea en los avances de la ciencia del gorrón en febrero de 2020.

El fondo

La técnica de CRISPR es una modificación de un método anterior desarrollado por los investigadores en la misma institución para eliminar apenas un defecto genético. Los investigadores adaptaron el método original para corregir la condición genética causada por la deficiencia del transcarbamylase dominante de la ornitina de la enzima (OTC).

3D que rinde corregir de la DNA de Crispr. Haber de imagen: Nathan Devery/Shutterstock
3D que rinde corregir de la DNA de Crispr. Haber de imagen: Nathan Devery/Shutterstock

La deficiencia de OTC ocurre en cerca de 1 en 40.000 activos soportada los bebés y puede ser debido sobre a 300 diversas mutaciones en el gen de OTC, situado en el cromosoma X. OTC es esencial para el funcionamiento normal del ciclo de la urea.

El ciclo de la urea es una enzima 6 de proceso que convierte el amoníaco tóxico en menos urea tóxica. Un defecto en ninguno de estos enzimas da lugar a la acumulación del amoníaco en la sangre, y por lo tanto al cerebro. Esta toxina causa daño a las células nerviosas sensibles del cerebro y puede incluso matar al paciente.

Puesto que el cromosoma X está presente en solamente una única copia en varones, el defecto se pone de manifiesto en el nacimiento, sobre todo en varones. Las hembras tienen 2 cromosomas de X, así que a menos que ambas lleven un defecto en este gen, la condición no se manifiesta clínico. En lugar, la hembra con un defecto en solamente uno de sus dos genes de OTC hace una onda portadora y puede pasar conectado el defecto a la mitad de su descendiente potencial. Otras mutaciones en el mismo gen producen otras condiciones genéticas.

El estudio

El tratamiento temprano es esencial en la mayoría de los desordenes genéticos debido a la expresión típicamente temprana de la anormalidad, que puede obstaculizar el revelado normal. Las terapias actuales se centran en vaciar el amoníaco por otros caminos que sean estimulados por el remedio. Si el defecto es muy severo, un trasplante del hígado puede ser requerido. Por otra parte, demasiados de estos pacientes mueren, y los clínicos que ven esta condición están buscando a menudo continuamente tratamientos perfeccionados.

La técnica

La técnica anterior era demasiado específica tratar esta enfermedad en la cual un de los sobre 300 mutaciones pudo estar presente. Por lo tanto, las personas se centraron en el diseño de un editor del genoma con un campo del uso más amplio. Esto es basada en la introducción de un minigene, o un equipo de instrucciones de la proteína-codificación, en las células de hígado, por un vector viral llamado un virus adeno-asociado (AAV). El minigene no altera la pieza defectuosa del gen sino agrega un nuevo equipo de instrucciones por un tipo aproximación del “cortar y pegar”.

Para esto, primero construyeron un vector doble modificado para requisitos particulares de AAV que contuvo Cas9, una proteína bacteriana que es conducida por el ARN para determinar y para corregir genes dentro de las células rápidamente. Este nuevo vector se llama AAV8, y emigra explícitamente hacia las células de hígado. El segundo AAV tiene un minigene que contenga la DNA del donante que codifica la enzima humana de OTC. Este minigene funcional es regulado por una serie del promotor que sea específica a las células de hígado. Esta salvaguardia se asegura de que sea expresada solamente dentro de las células de hígado después de ser inyectada en la sangre vía el AAV.

El Cas9 primer marca el cabo de la DNA en el sitio del objetivo dentro de la serie del gen. Ésta es la pieza del “corte” del proceso y es seguida por la “pasta,” donde el minigene se agrega vía un proceso de la reparación llamado reparación homología-dirigida.

La adición permitió que los ratones recién nacidos se convirtieran de una manera mucho más sana. En tres semanas de vida, los 25% de las células de hígado expresaban OTC, y en 8 semanas, los 35% mostraban esta expresión. Esto puede parecer como una diferencia modesta, pero sigue siendo tres y cuatro veces el efecto produjo por el uso del vector untargeted en estos puntos del tiempo, respectivamente.

Cuando el hígado fue examinado en estos puntos del tiempo, los investigadores encontraron los atados de las células OTC-que producían situadas en el hígado más o menos uniformemente. La diferencia persistió en vida adulta. Incluso en una dieta de alto valor proteico, los ratones apuntados mostraron a niveles del amoníaco el 60% más bajo que en ratones no tratados.

Las implicaciones

La diferencia es explicada por otro investigador, Lili Wang: “A diferencia de otras aproximaciones de CRISPR que supriman o modifiquen una porción del gen normal, esta técnica integra una nueva porción. No estamos intentando corregir las mutaciones que paran las células de hígado de producir OTC; estamos agregando este nuevo minigene así que las células pueden.”

El estudio muestra que esta nueva técnica CRISPR-basada se puede adaptar para prevenir las manifestaciones clínicas de una condición genética rara causada por mutaciones múltiples. Podría también ser utilizado para aliviar otras condiciones hereditarias causadas por otras mutaciones del mismo gen. La característica crítica de esta aproximación es que utiliza una estrategia para combate una condición causada por varias mutaciones en diversas partes del genoma, y no apenas una principal mutación.

El investigador James Wilson explica: “Aquí, movimos una aproximación de CRISPR adelante no sólo para sostener la expresión de OTC en las células pero también para ensanchar las capacidades de la herramienta. Nos hemos movido más cercano a un “espectro amplio potencial” gen-que corregían la aproximación para tratar a pacientes con la deficiencia de OTC, con independencia de la mutación y del estado clínico. El paso siguiente, con estudios preclínicos adicionales, es encontrar un sitio del puerto seguro en el gen en células de hígado humanas y después probar una aproximación gen-que corrige similar.”

Journal reference:

A mutation-independent CRISPR-Cas9–mediated gene targeting approach to treat a murine model of ornithine transcarbamylase deficiency, Lili Wang, Yang Yang, Camilo Breton, Peter Bell1, Mingyao Li, Jia Zhang, Yan Che, Alexei Saveliev, Zhenning He, John White, Caitlin Latshaw, Chenyu Xu, Deirdre McMenamin, Hongwei Yu, Hiroki Morizono, Mark L. Batshaw and James M. Wilson, Science Advances 12 Feb 2020, Vol. 6, no. 7, eaax5701, DOI: 10.1126/sciadv.aax5701

Dr. Liji Thomas

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Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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