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Nanopore revela a enzima dedeslocamento ligada à catálise

A universidade de cientistas de Groningen observou as características de uma única enzima dentro de um nanopore. Isto revelou que a enzima pode existir em quatro estados dobrados diferentes, ou os conformers, que jogam um papel activo no mecanismo da reacção. Estes resultados terão conseqüências para a engenharia de enzima e a revelação dos inibidores. O estudo foi publicado na química da natureza o 6 de abril.

nanoporeCréditos de imagem: Giovanni Maglia, universidade de Groningen/EurekAlert.com

As enzimas são as proteínas dobradas que têm uma estrutura tridimensional específica que crie um local activo que possa ligar uma carcaça e catalise uma reacção específica. Nos últimos anos, tornou-se claro que as enzimas não são estruturas rígidas mas que as proteínas dobradas existem como um conjunto de conformações no equilíbrio em torno de um estado à terra energètica estável.

Túnel de vento

Estudar a transição entre estados exige a observação de únicas enzimas por um período de tempo prolongado, que é desafiante. A universidade do professor adjunto de Groningen da biologia química Giovanni Maglia desenvolvido funil-deu forma aos nanopores que podem prender proteínas.

Medindo a corrente iónica através de tal nanopore, encaixado em uma membrana artificial do lipido, Maglia podia observar mudanças conformational nas enzimas. “Você poderia compará-lo com o estudo de um carro em um túnel de vento,” ele explica. “Abrir um indicador ou uma porta mudará o fluxo de ar. Em uma maneira similar, uma mudança na estrutura de dobramento da enzima muda a corrente iónica através do poro.”

Maglia usou seu sistema do nanopore para estudar o reductase do dihydrofolate da enzima (DHFR), que converte o dihydrofolate no tetrahydrofolate.

Nós escolhemos esta enzima porque foi estudada como um sistema modelo para a dinâmica da enzima por mais de trinta anos, usando todas as técnicas disponíveis. Além, os inibidores desta enzima, tais como o methotrexate, são usados como drogas anticancerosas.”

Giovanni Maglia, universidade de Groningen

Liberação eficiente

As medidas de DHFR revelaram a presença de quatro conformers diferentes, com afinidaoes diferentes para as carcaças. Maglia: “Comutar entre estes quatro estados era muito lenta. Isto significa que você pode somente os ver nestes tipos de únicos estudos duradouros da enzima.”

Adicionar o methotrexate do inibidor da reacção, que liga à enzima, causou uma transição muito rápida entre estados e mudou a afinidade das enzimas. “Nossa conclusão é que as reacções da enzima com compostos diferentes fornecem a energia livre para mudanças conformational,” diz Maglia.

Além disso, a mudança conformational igualmente mudou a afinidade das enzimas. Isto faz o sentido, enquanto a enzima precisa de ligar duas carcaças e, após ter terminado a reacção, deve liberar ambos. “A carcaça e o produto são moléculas muito similares, assim que a enzima precisa de mudar sua afinidade para uma liberação eficiente.”

Dois estados

Baseado nestes estudos, Maglia pode ver o interruptor da enzima entre dois estados: após ter ligado a carcaça, NADPH conduz a reacção que muda então a conformação da enzima e desse modo de sua afinidade. Subseqüentemente, ligar uma carcaça nova trá-la de volta ao primeiro estado. “Isto explica dois dos quatro conformers que nós observamos; nós não podemos ainda fazer o sentido dos outros dois,” Maglia admitimos. É impossível derivar a informação estrutural das medidas.

Não obstante, o estudo mostra a potência da tecnologia do nanopore em determinar as mudanças estruturais das enzimas. “Nós igualmente sabemos agora que esta enzima tem quatro estados à terra diferentes e deve comutar entre eles à função.” Isto adiciona um desafio ao projecto da enzima: não somente isto produzir um centro reactivo, mas deve igualmente permitir as mudanças conformational necessárias.

Isto pode explicar porque as enzimas artificial projetadas frequentemente não trabalham tão eficientemente quanto enzimas naturais. '”

Giovanni Maglia, universidade de Groningen

Finalmente, o estudo igualmente permitirá que os cientistas identifiquem as drogas de inibição novas que ligam mais apertado a DHFR do que o methotrexate.

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