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I biofisici rivelano il meccanismo molecolare dietro dal il pompaggio guidato da luminosa del sodio

Un gruppo di ricerca internazionale per la prima volta ha ottenuto la struttura della proteina dipompaggio sensibile alla luce KR2 nel suo stato attivo. La scoperta fornisce una descrizione del meccanismo dietro dal il trasferimento guidato da luminosa dello ione del sodio attraverso la membrana cellulare. Il documento è uscito nelle comunicazioni della natura.

KR2 è un membro molto di una famiglia numerosa dei rhodopsins microbici -- le proteine sensibili alla luce presentano nella membrana cellulare del archaea, dei batteri, dei virus e degli eucarioti. Queste proteine hanno una vasta gamma di funzioni, compreso dal il trasporto guidato da luminosa degli ioni attraverso la membrana. Tali canali ionici e pompe sono gli strumenti primari del optogenetics, un campo sviluppante in biomedicina con un fuoco sulle celle gestenti nell'organismo illuminandole con indicatore luminoso.

Optogenetics è venuto alla protuberanza dovuto i sui contributi alle tecniche come minimo dilaganti per la ricerca del cervello ed i trattamenti neurodegenerative di disordine che indirizzano Alzheimer, Parkinson ed altre malattie. Oltre il quel, optogenetics permette all'inversione la visione e della perdita dell'udito ed a riparare l'attività di muscolo.

Malgrado i suoi numerosi successi, ulteriore sviluppo del optogenetics è complicato dal numero limitato delle proteine disponibili adatte ad attivazione e ad inibizione delle cellule. Per esempio, lo strumento optogenetic più ampiamente usato, il channelrhodopsin 2, di cui la struttura originalmente è stata riferita nella scienza dai ricercatori e laureati di MIPT, può trasportare sia il sodio, potassio che ioni del calcio come pure protoni. La selettività bassa della proteina piombo agli effetti secondari indesiderabili sulle celle. Di conseguenza, ottimizzare i protocolli per mezzo degli strumenti optogenetic è corrente costosa e del tempo intensiva.

La ricerca di nuove, proteine più selettive è una priorità per il optogenetics. Uno dei candidati, il rhodopsin KR2 scoperto nel 2013, è uno strumento unico che trasporta selettivamente soltanto gli ioni del sodio attraverso la membrana nelle circostanze fisiologiche. Capendo come gli impianti KR2 è cruciali per l'ottimizzazione delle caratteristiche funzionali di quella proteina ed usando come la base per i nuovi strumenti optogenetic.

I biofisici di MIPT hanno pubblicato le prime strutture di KR2 nei sui vari moduli nel 2015 e in 2019. Tra l'altro, hanno indicato che la proteina organizza nei pentameri nella membrana e che tale comportamento è vitale al suo funzionamento.

Tuttavia, tutti i modelli descritti finora hanno esaminato la proteina nel suo inattivo, o nello stato fondamentale. Eppure è soltanto nello stato attivo -- dopo illuminazione -- che la proteina realmente trasporta il sodio. Per capire come la pompa KR2 funziona, i ricercatori ora hanno ottenuto e descritto la sua struttura ad alta definizione nello stato attivo.

Abbiamo cominciato utilizzando l'approccio tradizionale, attivando KR2 nei cristalli della proteina del pregrown illuminandoli con un laser ed ottenendo un'istantanea dello stato attivo rapido congelando i cristalli a 100 kelvins. Abbiamo ottenuto fortunati, perché tali manipolazioni possono distruggere bene i cristalli. Per evitare questo, abbiamo dovuto regolare la lunghezza d'onda del laser ed alimentare e trovare il tempo di esposizione ottimale.„

Kirill Kovalev, il primo autore dello studio, studente di laurea di MIPT

La produzione dei il grande numero cristalli di alta qualità di rhodopsin KR2 necessari per gli esperimenti è stata permessa dalla strumentazione unica del centro di ricerca di MIPT per i meccanismi molecolari di invecchiamento e delle malattie relative all'età.

L'individuazione più significativa dello studio sta identificando i residui dell'amminoacido della proteina che legano lo ione del sodio dentro la molecola KR2. Sono il fattore che determina la selettività di rhodopsin verso un tipo particolare di ioni. Oltre a quello, una struttura ad alta definizione per lo stato attivo della proteina a 2,1 angstrom -- 21 hundred-billionths di un metro -- ha rivelato la configurazione precisa della sede del legame dello ione del sodio al centro attivo della proteina. Per la prima volta, il gruppo ha indicato che la sede del legame di KR2 è stato ottimizzata per gli ioni del sodio nel corso di evoluzione di rhodopsin. Ciò significa che la struttura dello stato attivo ottenuta in studio è più adatta per la progettazione razionale degli strumenti optogenetic di prossima generazione di KR2-based.

“Nel corso del nostro lavoro, egualmente abbiamo ottenuto la struttura dello attivo-stato KR2 alla temperatura ambiente,„ Kovalev ha aggiunto. “Per raggiungere questo, abbiamo dovuto aggiornare i protocolli ben noti per la raccolta dei dati cristallografici. Inoltre, abbiamo impiegato una sorgente delle radiazioni del sincrotrone per fare leva le tecniche seriali della cristallografia, che stanno sviluppando popolari ora.„

La struttura di temperatura ambiente KR2 ha confermato che il modello della proteina prodotto da un'istantanea a bassa temperatura è corretto. Ciò ha fornito una dimostrazione diretta che il congelamento criogenico non ha danneggiato la struttura interna dei rhodopsin.

Le strutture riferite nel documento hanno permesso che gli scienziati fornissero una descrizione mai vista dal del trasporto di ione guidato da luminosa attivo del sodio attraverso la membrana cellulare. Specificamente, lo studio indica che il trasporto del sodio molto probabilmente comprende un meccanismo ibrido compreso tramite il trasporto del protone del relè e la diffusione passiva dello ione attraverso le intercapedini polari nella proteina. Il meccanismo proposto dai ricercatori è stato confermato via gli studi funzionali sui moduli mutati KR2 e le simulazioni di dinamica molecolare dello ione del sodio rilasciano dalla proteina.

“Il trasporto di ione attraverso la membrana cellulare è un trattamento biologico fondamentale. Che detto, il trasporto di ione del sodio dovrebbe essere permesso a da un meccanismo distinto da quello in questione nel trasporto del protone,„ spiega Valentin Gordeliy, il Direttore per la ricerca all'istituto di Grenoble per biologia strutturale ed al coordinatore scientifico del centro di ricerca di MIPT per i meccanismi molecolari di invecchiamento e delle malattie relative all'età. “Per la prima volta, vediamo come uno ione del sodio è limitato dentro la molecola di rhodopsin e capiamo il meccanismo per la versione dello ione nello spazio intercellulare.„

I biofisici sono convinti che i loro risultati non solo rivelino i principi fondamentali che sono alla base del trasporto di ione attraverso la membrana ma saranno utili al optogenetics. MIPT sta continuando lo sviluppo dei moduli ottimizzati della proteina KR2 per espandere il toolkit per la ricerca del cervello e le terapie neurodegenerative di malattia.

Source:
Journal reference:

Kovalev, K., et al. (2020) Molecular mechanism of light-driven sodium pumping. Nature Communications. doi.org/10.1038/s41467-020-16032-y.