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Os biofísicos revelam o mecanismo molecular atrás do bombeamento luz-conduzido do sódio

Uma equipa de investigação internacional tem obtido pela primeira vez a estrutura da proteína KR2 debombeamento sensível à luz em seu estado activo. A descoberta fornece uma descrição do mecanismo atrás de transferência luz-conduzida do íon do sódio através da membrana de pilha. O papel saiu em comunicações da natureza.

KR2 é um membro de uma família muito grande de rhodopsins microbianos -- as proteínas sensíveis à luz apresentam na membrana de pilha do archaea, das bactérias, dos vírus, e dos eukaryotes. Estas proteínas têm uma vasta gama de funções, incluindo o transporte luz-conduzido dos íons através da membrana. Tais canais e bombas do íon são as ferramentas preliminares do optogenetics, um campo crescendo na biomedicina com um foco em pilhas de controlo no corpo iluminando as com luz.

Optogenetics veio à proeminência devido a suas contribuições para técnicas mìnima invasoras para a pesquisa do cérebro e os tratamentos neurodegenerative da desordem que endereçam Alzheimer, Parkinson, e outras doenças. Além do esse, o optogenetics permite a inversão da perda da visão e da audição e a restauração da actividade de músculo.

Apesar de seus muitos sucessos, uma revelação mais adicional do optogenetics é complicada pelo número limitado de proteínas disponíveis apropriadas para a activação e a inibição da pilha. Por exemplo, a ferramenta optogenetic a mais amplamente utilizada, o channelrhodopsin 2, cuja a estrutura foi relatada originalmente na ciência por pesquisadores e graduados de MIPT, pode transportar o sódio, o potássio, e os íons do cálcio, assim como os protão. A baixa selectividade da proteína conduz aos efeitos secundários indesejáveis em pilhas. Em conseqüência, aperfeiçoar os protocolos para usar ferramentas optogenetic é actualmente caro e tempo-intensivo.

A busca para proteínas novas, mais selectivas é uma prioridade para o optogenetics. Um dos candidatos, o rhodopsin KR2 descoberto em 2013, é uma ferramenta original que transporte selectivamente somente os íons do sódio através da membrana sob circunstâncias fisiológicos. Compreendendo como os trabalhos KR2 são cruciais para aperfeiçoar as características funcionais dessa proteína e as usar como a base para ferramentas optogenetic novas.

Os biofísicos de MIPT publicaram as primeiras estruturas de KR2 em seus vários formulários em 2015 e em 2019. Entre outras coisas, mostraram que a proteína organiza em pentamers na membrana, e que tal comportamento é vital ao seu funcionamento.

Contudo, todos os modelos descritos até agora olharam a proteína em seu estado inactivo, ou à terra. Contudo está somente no estado activo -- após a iluminação -- que a proteína transporta realmente o sódio. Para compreender como a bomba KR2 funciona, os pesquisadores têm obtido e têm descrito agora sua estrutura de alta resolução no estado activo.

Nós começamos usando a aproximação tradicional, ativando KR2 em cristais da proteína do pregrown iluminando os com um laser e obtendo um instantâneo do estado activo ràpida congelando os cristais em 100 kelvins. Nós obtivemos afortunados, porque tais manipulações podem bem destruir os cristais. Para evitar isto, nós tivemos que ajustar o comprimento de onda do laser e pôr e encontrar o tempo de exposição óptimo.”

Kirill Kovalev, o primeiro autor do estudo, estudante doutoral de MIPT

Produzir o grande número dos cristais de alta qualidade do rhodopsin KR2 necessários para as experiências foi tornada possível pelo equipamento original do centro de pesquisa de MIPT para mecanismos moleculars do envelhecimento e de doenças relativas à idade.

Encontrar o mais significativo do estudo está identificando os resíduos do ácido aminado da proteína que ligam o íon do sódio dentro da molécula KR2. São o factor que determina a selectividade do rhodopsin para um tipo particular de íons. Além do que isso, uma estrutura de alta resolução para o estado activo da proteína em 2,1 ångströms -- 21 hundred-billionths de um medidor -- revelou a configuração precisa do local obrigatório do íon do sódio no centro activo da proteína. Pela primeira vez, a equipe mostrou que o local obrigatório de KR2 se tornou aperfeiçoado para íons do sódio no curso da evolução do rhodopsin. Isto significa que a estrutura do estado activo obtida no estudo melhor-está serida para o projecto racional de ferramentas optogenetic da próxima geração KR2-based.

“No curso de nosso trabalho, nós igualmente obtivemos a estrutura do activo-estado KR2 na temperatura ambiente,” Kovalev adicionou. “Para conseguir isto, nós tivemos que actualizar os protocolos conhecidos para recolher dados crystallographic. Além disso, nós empregamos uma fonte de radiação do synchrotron para leverage as técnicas de série do cristalografia, que estão crescendo populares agora.”

A estrutura da temperatura ambiente KR2 confirmou que o modelo da proteína produzido de um instantâneo de baixa temperatura está correcto. Isto forneceu uma demonstração directa que a congelação criogênica não afectou a estrutura interna dos rhodopsin.

As estruturas relatadas no papel permitiram que os cientistas forneçam uma primeira-nunca descrição do transporte de íon luz-conduzido activo do sódio através da membrana de pilha. Especificamente, o estudo mostra que o transporte do sódio envolve muito provavelmente um mecanismo híbrido compreendido pelo transporte do protão do relé e pela difusão passiva do íon através das cavidades polares na proteína. O mecanismo propor pelos pesquisadores foi confirmado através dos estudos funcionais dos formulários KR2 transformados e as simulações da dinâmica molecular do íon do sódio liberam-se da proteína.

De “o transporte íon através da membrana de pilha é um processo biológico fundamental. Que dito, o transporte de íon do sódio deve ser permitido por um mecanismo distinto daquele envolvido no transporte do protão,” explica Valentin Gordeliy, director para a pesquisa no instituto de Grenoble para a biologia estrutural e no coordenador científico do centro de pesquisa de MIPT para mecanismos moleculars do envelhecimento e de doenças relativas à idade. “Pela primeira vez, nós vemos como um íon do sódio é limitado dentro da molécula do rhodopsin e compreendemos o mecanismo para a liberação do íon no espaço intercellular.”

Os biofísicos são convencidos que seus resultados não somente para revelar os princípios fundamentais que são a base do transporte de íon através da membrana mas serão do uso ao optogenetics. MIPT está continuando a revelação de formulários aperfeiçoados da proteína KR2 a expandir o conjunto de ferramentas para a pesquisa do cérebro e terapias neurodegenerative da doença.

Source:
Journal reference:

Kovalev, K., et al. (2020) Molecular mechanism of light-driven sodium pumping. Nature Communications. doi.org/10.1038/s41467-020-16032-y.