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Los biofísicos revelan el mecanismo molecular detrás del bombeo luz-impulsado del sodio

Un equipo de investigación internacional ha obtenido por primera vez la estructura de la proteína de sodio-bombeo sensible a la luz KR2 en su estado activo. El descubrimiento ofrece una descripción del mecanismo detrás de la transferencia luz-impulsada del ión del sodio a través de la membrana celular. El papel salió en comunicaciones de la naturaleza.

KR2 es una pieza de una familia muy grande de rhodopsins microbianos -- las proteínas sensibles a la luz presentan en la membrana celular del archaea, de bacterias, de virus, y de eucariotas. Estas proteínas tienen una amplia gama de funciones, incluyendo el transporte luz-impulsado de iones a través de la membrana. Tales canales y bombas del ión son las herramientas primarias del optogenetics, un campo floreciente en biomedecina con un foco en las células que controlan en la carrocería iluminándolas con la luz.

Optogenetics vino a la prominencia debido a sus contribuciones a las técnicas como mínimo invasores para la investigación del cerebro y los tratamientos neurodegenerative del desorden que dirigían Alzheimer, Parkinson, y otras enfermedades. Más allá de ese, el optogenetics habilita la inversión de pérdida de la visión y de oído y restablecer actividad de músculo.

A pesar de sus numerosos éxitos, el revelado adicional del optogenetics es complicado por el número limitado de proteínas disponibles convenientes para la activación y la inhibición de la célula. Por ejemplo, la herramienta optogenetic más ampliamente utilizada, el channelrhodopsin 2, cuya estructura fue denunciada originalmente en ciencia por los investigadores y los graduados de MIPT, puede transportar el sodio, potasio, y los iones del calcio, así como los protones. La selectividad inferior de la proteína lleva a los efectos secundarios indeseables sobre las células. Como consecuencia, la optimización de los protocolos para usar las herramientas optogenetic es actualmente costosa y tiempo-intensiva.

La búsqueda para las proteínas nuevas, más selectivas es una prioridad para el optogenetics. Uno de los candidatos, el rhodopsin KR2 descubierto en 2013, es una herramienta única que transporta selectivamente solamente los iones del sodio a través de la membrana bajo condiciones fisiológicas. Entendiendo cómo los trabajos KR2 son cruciales para optimizar las características funcionales de esa proteína y usarlas como la base para las nuevas herramientas optogenetic.

Los biofísicos de MIPT publicaron las primeras estructuras de KR2 en sus diversas formas en 2015 y 2019. Entre otras cosas, mostraron que la proteína ordena en pentámeros en la membrana, y que tal comportamiento es vital a su funcionamiento.

Sin embargo, todos los modelos descritos hasta ahora han observado la proteína en su estado inactivo, o de tierra. Con todo está solamente en el estado activo -- después de la iluminación -- que la proteína transporta real el sodio. Para entender cómo la bomba KR2 funciona, los investigadores ahora han obtenido y han descrito su estructura de alta resolución en el estado activo.

Comenzamos usando la aproximación tradicional, activando KR2 en cristales de la proteína del pregrown iluminándolos con un laser y consiguiendo una foto del estado activo rápidamente congelando los cristales en 100 kelvins. Conseguimos afortunados, porque tales manipulaciones bien pueden destruir los cristales. Para evitar esto, tuvimos que ajustar la longitud de onda del laser y mover por motor y encontrar el tiempo de exposición óptimo.”

Kirill Kovalev, el primer autor del estudio, estudiante doctoral de MIPT

Producir el gran número de cristales de alta calidad del rhodopsin KR2 necesarios para los experimentos ha sido hecha posible por el equipo único del centro de investigación de MIPT para los mecanismos moleculares del envejecimiento y de las enfermedades relativas a la edad.

El encontrar más importante del estudio está determinando los residuos del aminoácido de la proteína que atan el ión del sodio dentro de la molécula KR2. Son el factor que determina la selectividad del rhodopsin hacia un tipo determinado de iones. Además de eso, una estructura de alta resolución para el estado activo de la proteína en 2,1 angstromes -- 21 hundred-billionths de un contador -- ha revelado la configuración exacta del punto de enlace del ión del sodio en el centro activo de la proteína. Por primera vez, las personas mostraron que el punto de enlace de KR2 se ha optimizado para los iones del sodio en el curso de la evolución del rhodopsin. Esto significa que la estructura del estado activo obtenida en el estudio es más adecuada para el diseño racional de las herramientas optogenetic de la siguiente-generación KR2-based.

“En el curso de nuestro trabajo, también obtuvimos la estructura del activo-estado KR2 en la temperatura ambiente,” Kovalev agregó. “Para lograr esto, tuvimos que poner al día los protocolos bien conocidos para cerco datos cristalográficos. Además, empleamos una fuente de radiación de sincrotrón para leverage las técnicas seriales de la cristalografía, que están creciendo populares ahora.”

La estructura de la temperatura ambiente KR2 confirmó que el modelo de la proteína producido de una foto a baja temperatura está correcto. Esto ofreció una demostración directa que la congelación criogénica no afectó a la estructura interna de los rhodopsin.

Las estructuras denunciadas en el papel han permitido que los científicos ofrezcan una primera descripción del transporte de ión luz-impulsado activo del sodio a través de la membrana celular. Específicamente, el estudio muestra que el transporte del sodio implica muy probablemente un mecanismo híbrido comprendido por transporte del protón del relevo y la difusión pasiva del ión a través de las cavidades polares en la proteína. El mecanismo propuesto por los investigadores se ha confirmado vía estudios funcionales de las formas transformadas KR2 y las simulaciones de la dinámica molecular del ión del sodio liberan de la proteína.

El “transporte de ión a través de la membrana celular es un proceso biológico fundamental. Que dicho, el transporte de ión del sodio se debe habilitar por un mecanismo distinto de ése implicado en transporte del protón,” explica a Valentin Gordeliy, el director para la investigación en el instituto de Grenoble para la biología estructural y el coordinador científico del centro de investigación de MIPT para los mecanismos moleculares del envejecimiento y de las enfermedades relativas a la edad. “Por primera vez, vemos cómo un ión del sodio está limitado dentro de la molécula del rhodopsin y entendemos el mecanismo para la baja del ión en el espacio intercelular.”

Convencen de que sus conclusión no sólo revelan los principios fundamentales que son la base de transporte de ión a través de la membrana pero serán los biofísicos de uso al optogenetics. MIPT está continuando el revelado de las formas optimizadas de la proteína KR2 para desplegar la caja de herramientas para la investigación del cerebro y las terapias neurodegenerative de la enfermedad.

Source:
Journal reference:

Kovalev, K., et al. (2020) Molecular mechanism of light-driven sodium pumping. Nature Communications. doi.org/10.1038/s41467-020-16032-y.