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Il primo schermo genoma di ampiezza di CRISPR rivela i geni che gestiscono l'infezione SARS-CoV-2

Eseguendo uno schermo genoma di ampiezza di CRISPR sul coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo, i ricercatori degli Stati Uniti hanno identificato i geni proviral novelli e le vie ed hanno evidenziato i geni ospite che possono regolamentare la patogenesi di malattia di coronavirus (COVID-19) come pure gli obiettivi potenziali rivelanti per gli approcci novelli del trattamento. I loro risultati sono attualmente disponibili sul " server " della pubblicazione preliminare del bioRxiv*.

Poichè non c'sono nessun vaccini o terapeutica approvata attualmente disponibili per controllo di malattie, la pandemia in corso di COVID-19 rappresenta un rischio significativo per i sistemi di salute pubblica intorno al mondo. Ciò può essere estendere ad altri coronaviruses emergenti, che già abbiamo incontrato (quali i SAR-CoV e il MERS-CoV originali), o a quei che rappresentino una minaccia per il futuro.

L'entrata di SARS-CoV-2 (cioè, l'agente causativo della malattia COVID-19) nella cella rappresenta il primo punto nel suo ciclo di vita, che è mediato dalla proteina virale della punta che lega all'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2) del ricevitore della superficie delle cellule. L'ultimo è un determinante significativo dell'intervallo ospite e del tropismo delle cellule.

Tuttavia, un secondo evento proteolitico è autorizzato per esporre il peptide virale di fusione e permettere alla fusione della membrana. Ciò può accadere alla membrana di plasma della cellula bersaglio dalla proteasi 2 serina tipi del transmembrane (TMPRSS2) o nel endosome da catepsina L.

A seguito della fusione della membrana virale, il materiale genetico virale è scaricato nel citoplasma delle cellule umane; là, è tradotto e stabilisce i complessi della trascrizione e della replicazione virale prima del raduno e del germogliamento. Eppure, i geni ospite che mediano questi trattamenti rimangono evasivi.

Ciò nonostante, l'identificazione dei fattori ospite che permettono al trattamento di infezione è di massima importanza per informare i meccanismi della patogenesi COVID-19, rivela le variazioni di predisposizione ospite, ma anche per identificare le nuove terapie host-dirette con vasta efficacia.

Quindi, per scoprire i geni ospite necessari per la morte di infezione SARS-CoV-2 e delle cellule, i ricercatori da Yale, Massachusetts Institute of Technology, Harvard, la scuola di medicina di Icahn e l'università del Texas hanno generato una libreria completamente novella di CRISPR ed hanno perseguito il primo schermo genoma di ampiezza di CRISPR con SARS-CoV-2.

Uno sforzo genoma di ampiezza della selezione

Per identificare i geni ospite indispensabili per la sopravvivenza delle cellule in risposta a SARS-CoV-2, questo gruppo di ricercatori ha deciso di usare la linea cellulare Vero-E6 del cercopiteco africano, che è altamente favorevole all'infezione SARS-CoV-2 e dagli agli effetti citopatici indotti da virus.

Di conseguenza, hanno eseguito due sforzi genoma di ampiezza indipendenti della selezione usando una libreria riunita genoma di ampiezza di CRISPR formata 83.963 dalla guida singola d'ottimizzazione RNAs, con una media quattro di singola guida RNAs per gene e mille unico guide d'ottimizzazione RNAs di controllo.

L'identificazione esatta dei geni proviral conosciuti ACE2 e della catepsina L ha dimostrato la qualità tecnica dello schermo, fornente la fiducia nell'individuazione dei geni supplementari la tendenza a regolamentare l'infezione SARS-CoV-2.

Come prova-de-principio, i ricercatori egualmente hanno provato parecchi piccoli inibitori della molecola, che hanno provocato l'identificazione di tre molecole che hanno avute la capacità di inibire la replica SARS-CoV-2 e dalla la morte indotta da virus successiva delle cellule.

lo schermo Genoma di ampiezza di CRISPR identifica i geni critici per la morte delle cellule di SARS-CoV-2-induced. (A) Disegno schematico dello schermo riunito. Le celle Vero-E6 che esprimono Cas9 transduced con la libreria genoma di ampiezza di sabaeus del C. via il lentivirus. La popolazione transduced delle cellule poi ha ricevuto un trattamento falso o è stata sfidata con SARS-CoV-2 nei vari stati della cultura. Le celle sopravviventi da ogni circostanza sono state isolate e le sequenze dello sgRNA sono state ampliate dalla PCR e sono state ordinate. (B) tracciato del vulcano che mostra resistenza di conferimento e sensibilità dei geni superiori a SARS-CoV-2. Del il z-punteggio livello del gene e - log10 (FDR) erano entrambi calcolati facendo uso della media dei cinque stati Cas9-v2. Non mirando agli sgRNAs di controllo sono stati raggruppati a caso in serie di 4 per servire da geni “fittizi„ e sono indicati nel verde. (C) prestazione della guida determinata RNAs che mira a ACE2, a SMARCA4, a CTSL e a TMPRSS2. Il residuo medio attraverso i cinque stati Cas9-v2 è tracciato per la libreria piena (cima) e per 4 la guida RNAs che mira ad ogni gene. (D) Heatmaps dei 25 colpi principali del gene per resistenza e la sensibilità, allineati dal z-punteggio medio negli stati Cas9-v2.I geni che sono inclusi in uno degli insiemi del gene contrassegnati dentro (fico 2A) sono colorati di conseguenza. Condizioni la a: Ciao-MOI di Cas9v2 D5 2.5e6; b: Ciao-MOI di Cas9v2 D5 5e6; c: Ciao-MOI di Cas9v2 D2 5e6; d: Ciao-MOI di Cas9v2 D10 5e6; e: Lo-MOI di Cas9v2 D5 2.5e6.
lo schermo Genoma di ampiezza di CRISPR identifica i geni critici per la morte delle cellule di SARS-CoV-2-induced. (A) Disegno schematico dello schermo riunito. Le celle Vero-E6 che esprimono Cas9 transduced con la libreria genoma di ampiezza di sabaeus del C. via il lentivirus. La popolazione transduced delle cellule che o ricevuta un trattamento falso o è stata sfidata con SARS-CoV-2 nei vari stati della cultura. Le celle sopravviventi da ogni circostanza sono state isolate e le sequenze dello sgRNA sono state ampliate dalla PCR e sono state ordinate. (B) tracciato del vulcano che mostra resistenza di conferimento e sensibilità dei geni superiori a SARS-CoV-2. Del il z-punteggio livello del gene e - log10 (FDR) erano entrambi calcolati facendo uso della media dei cinque stati Cas9-v2. Non mirando agli sgRNAs di controllo sono stati raggruppati a caso in serie di 4 per servire da geni “fittizi„ e sono indicati nel verde. (C) prestazione della guida determinata RNAs che mira a ACE2, a SMARCA4, a CTSL e a TMPRSS2. Il residuo medio attraverso i cinque stati Cas9-v2 è tracciato per la libreria piena (cima) e per 4 la guida RNAs che mira ad ogni gene. (D) Heatmaps dei 25 geni principali colpiti per resistenza e la sensibilità, allineato dal z-punteggio medio negli stati Cas9-v2. I geni che sono inclusi in uno degli insiemi del gene contrassegnati dentro (fico 2A) sono colorati di conseguenza. Condizioni la a: Ciao-MOI di Cas9v2 D5 2.5e6; b: Ciao-MOI di Cas9v2 D5 5e6; c: Ciao-MOI di Cas9v2 D2 5e6; d: Ciao-MOI di Cas9v2 D10 5e6; e: Lo-MOI di Cas9v2 D5 2.5e6.

Una panoplia dei geni in questione nell'infezione SARS-CoV-2

“Abbiamo scoperto i geni coinvolgere nei diversi trattamenti biologici compreso cromatina che ricostruisce, la modifica dell'istone, segnalazione cellulare ed il regolamento del RNA,„ autori di studio sottolinea i loro risultati principali nel documento disponibile su bioRxiv.

I ricercatori hanno valutato 25 di questi geni con la unico guida determinata RNAs in un formato allineato, compreso sia i geni proviral che antivirali ed hanno segnato i piccoli antagonisti con esattezza della molecola che assicurano la protezione contro l'infezione SARS-CoV-2 e la morte successiva delle cellule.

In breve, i ricercatori hanno identificato i fattori già conosciuti ospite SARS-CoV-2 - compreso il ricevitore ACE2 e la catepsina L della proteasi - ma anche i geni proviral novelli e le vie. Le scoperte recenti hanno consistito di una cromatina specifica che ricostruisce le componenti complesse e cruciali via di segnalazione di fattore di crescita di trasformazione di beta, che appartengono alla superfamiglia delle citochine multifunzionali.

“Interessante, non abbiamo individuato parecchi geni precedentemente implicati nell'infezione SARS-CoV-2 compreso TMPRSS2, PIKFyve e TPC2 che suggeriscono che questi geni siano o non essenziali in un modo cella-intrinseco di Vero o che la ridondanza funzionale esista con altri geni„, ulteriori spiegano gli autori di studio.

Studi la casella di gruppo anche rivelata di alto-mobilità di alarmin degli autori 1 (HMGB1) come componente chiave per la replica SARS-CoV-2; per contro, la perdita di complesso del chaperon dell'istone H3.3 ha innescato le celle infettate dalla alla morte indotta da virus delle cellule.

Obiettivi potenziali di trattamento di rivelazione

Evidenziando una schiera dei geni proviral ed antivirali ospite, questo studio ha implicazioni sostanziali per la nostra comprensione della patogenesi COVID-19, del trattamento e della progettazione vaccino - specialmente rivelando gli obiettivi terapeutici potenziali per SARS-CoV-2.

Più specificamente, i geni e le vie che sono stati identificati in questo studio possono spiegare la variazione della presentazione di malattia, che può correlare positivamente con i geni di resistenza, ma negativamente correlano con i geni della sensibilizzazione a cellulare, al tessuto ed al livello dell'organismo.

“È intrigante speculare che la cromatina ed i geni dimodificazione identificati qui contribuiscono all'espressione di un programma proviral eterogeneo di espressione genica che potenzialmente regolamenta ACE2 ed altri geni d'interazione virali„, dicono gli autori di studio.

In conclusione, questo studio rappresenta il primo schermo genetico genoma di ampiezza svolto con tutto il coronavirus, con i risultati largamente applicabili che possono richiedere lo sviluppo dei trattamenti host-diretti contro gli attuali e sforzi pandemici futuri dei coronaviruses.

Rete degli insiemi del gene. I vertici rappresentano gli insiemi significativamente arricchiti del gene. La dimensione di ogni insieme del gene è proporzionale al suo z-punteggio assoluto medio. Gli insiemi del gene sono colorati tramite la direzione in cui segnano. Le barriere rappresentano la sovrapposizione significativa fra gli insiemi del gene. La trasparenza di ogni barriera è proporzionale alla frazione dei geni compartecipi da due insiemi del gene. Gli insiemi del gene sono stati ragruppati facendo uso dell
La rete degli insiemi del gene. I vertici rappresentano gli insiemi significativamente arricchiti del gene. La dimensione di ogni insieme del gene è proporzionale al suo z-punteggio assoluto medio. Gli insiemi del gene sono colorati tramite la direzione in cui segnano. Le barriere rappresentano una sovrapposizione significativa fra gli insiemi del gene. La trasparenza di ogni barriera è proporzionale alla frazione dei geni compartecipi da due insiemi del gene. Gli insiemi del gene sono stati ragruppati facendo uso dell'algoritmo del infomap e l'insieme più centrale da PageRank è contrassegnato per ogni cluster. L'algoritmo di Fruchterman-Reingold è stato usato per presentare la rete.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Tomislav Meštrović

Written by

Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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