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A primeira tela genoma-larga de CRISPR revela os genes que controlam a infecção SARS-CoV-2

Executando uma tela genoma-larga de CRISPR no coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), os pesquisadores dos E.U. identificaram genes proviral novos e caminhos, e destacaram os genes do anfitrião que podem regular a patogénese da doença do coronavirus (COVID-19), assim como alvos potenciais de revelação para aproximações novas do tratamento. Seus resultados estão actualmente disponíveis no server da pré-impressão do bioRxiv*.

Porque nenhuma vacina ou terapêutica aprovada estão actualmente disponível para o controlo de enfermidades, a pandemia em curso de COVID-19 representa um risco significativo para sistemas da saúde pública em todo o mundo. Isto pode ser estendido a outros coronaviruses emergentes, que nós temos encontrado já (como os SARS-CoV e o MERS-CoV originais), ou a esses que levantam uma ameaça para o futuro.

A entrada de SARS-CoV-2 (isto é, o agente causal da doença COVID-19) na pilha representa a primeira etapa em seu ciclo de vida, que é negociado pela proteína viral do ponto que liga à enzima deconversão 2 do receptor da superfície da pilha (ACE2). O último é uma causa determinante significativa da escala do anfitrião e do tropismo da pilha.

Contudo, um segundo evento proteolytic é justificado a fim expr o peptide viral da fusão e permitir a fusão da membrana. Isto pode ocorrer na membrana de plasma da pilha de alvo pelo serine-tipo 2 do protease da transmembrana (TMPRSS2) ou no endosome pela catepsina L.

Depois da fusão da membrana viral, o material genético viral é liberado no citoplasma de pilhas humanas; lá, é traduzido e estabelece complexos virais da réplica e da transcrição antes da reunião e de brotar. Ainda, os genes do anfitrião que negociam estes processos permanecem indescritíveis.

Todavia, a identificação dos factores do anfitrião que permitem o processo da infecção é da importância máxima para informar mecanismos da patogénese COVID-19, revela variações da susceptibilidade do anfitrião, mas para identificar igualmente terapias anfitrião-dirigidas novas com eficácia larga.

Daqui, para descobrir os genes do anfitrião necessários para a infecção SARS-CoV-2 e a morte celular, os pesquisadores de Yale, Massachusetts Institute of Technology, Harvard, a Faculdade de Medicina de Icahn, e a Universidade do Texas geraram uma biblioteca completamente nova de CRISPR e levaram a cabo a primeira tela genoma-larga de CRISPR com SARS-CoV-2.

Um esforço genoma-largo da selecção

A fim identificar os genes do anfitrião indispensáveis para a sobrevivência da pilha em resposta a SARS-CoV-2, este grupo de pesquisadores decidiu usar a linha celular Vero-E6 do macaco verde africano, que é altamente favorável à infecção SARS-CoV-2 e aos efeitos cytopathic vírus-induzidos.

Conseqüentemente, executaram dois esforços genoma-largos independentes da selecção usando uma biblioteca associada genoma-larga de CRISPR compreendida 83.963 do único guia de escolha de objectivos RNAs, com uma média quatro do único guia RNAs pelo gene, e mil único-guias deescolha de objectivos RNAs do controle.

A identificação exacta dos genes proviral conhecidos ACE2 e da catepsina L demonstrou a qualidade técnica da tela, fornecendo a confiança em encontrar os genes adicionais a propensão regular a infecção SARS-CoV-2.

Como um prova--princípio, os pesquisadores igualmente testaram diversos inibidores pequenos da molécula, que conduziram à identificação de três moléculas que tiveram a capacidade inibir a réplica SARS-CoV-2 e a morte celular vírus-induzida subseqüente.

a tela Genoma-larga de CRISPR identifica os genes críticos para a morte celular de SARS-CoV-2-induced. (a) Diagrama esquemático da tela associada. As pilhas Vero-E6 que expressam Cas9 transduced com a biblioteca genoma-larga do sabaeus do C. através do lentivirus. A população transduced da pilha recebeu um tratamento trocista ou foi desafiada então com o SARS-CoV-2 sob várias condições da cultura. As pilhas da sobrevivência de cada circunstância foram isoladas e as seqüências do sgRNA foram amplificadas pelo PCR e arranjadas em seqüência. (b) Lote do vulcão que mostra a resistência conferindo e a sensibilidade dos genes superiores a SARS-CoV-2. A z-contagem do gene-nível e - log10 (FDR) eram ambos calculados usando o meio das cinco condições Cas9-v2. Não-visando sgRNAs do controle foram agrupados aleatòria em jogos de 4 para servir como genes do “manequim” e são mostrados no verde. (c) Desempenho do guia individual RNAs que visa ACE2, SMARCA4, CTSL, e TMPRSS2. O resíduo médio através das cinco condições Cas9-v2 é traçado para a biblioteca completa (parte superior) e para 4 o guia RNAs que visa cada gene. (d) Heatmaps das 25 batidas superiores do gene para a resistência e a sensibilidade, classificadas pela z-contagem média nas condições Cas9-v2.Os genes que são incluídos em um dos grupos do gene etiquetados dentro (figo 2A) são coloridos em conformidade. Condicione a: Olá!-MOI de Cas9v2 D5 2.5e6; b: Olá!-MOI de Cas9v2 D5 5e6; c: Olá!-MOI de Cas9v2 D2 5e6; d: Olá!-MOI de Cas9v2 D10 5e6; e: Lo-MOI de Cas9v2 D5 2.5e6.
a tela Genoma-larga de CRISPR identifica os genes críticos para a morte celular de SARS-CoV-2-induced. (a) Diagrama esquemático da tela associada. As pilhas Vero-E6 que expressam Cas9 transduced com a biblioteca genoma-larga do sabaeus do C. através do lentivirus. A população transduced da pilha do que ou recebida um tratamento trocista ou foi desafiada com o SARS-CoV-2 sob várias condições da cultura. As pilhas da sobrevivência de cada circunstância foram isoladas e as seqüências do sgRNA foram amplificadas pelo PCR e arranjadas em seqüência. (b) Lote do vulcão que mostra a resistência conferindo e a sensibilidade dos genes superiores a SARS-CoV-2. A z-contagem do gene-nível e - log10 (FDR) eram ambos calculados usando o meio das cinco condições Cas9-v2. Não-visando sgRNAs do controle foram agrupados aleatòria em jogos de 4 para servir como genes do “manequim” e são mostrados no verde. (c) Desempenho do guia individual RNAs que visa ACE2, SMARCA4, CTSL, e TMPRSS2. O resíduo médio através das cinco condições Cas9-v2 é traçado para a biblioteca completa (parte superior) e para 4 o guia RNAs que visa cada gene. (d) Heatmaps dos 25 genes superiores batidos para a resistência e a sensibilidade, classificado pela z-contagem média nas condições Cas9-v2. Os genes que são incluídos em um dos grupos do gene etiquetados dentro (figo 2A) são coloridos em conformidade. Condicione a: Olá!-MOI de Cas9v2 D5 2.5e6; b: Olá!-MOI de Cas9v2 D5 5e6; c: Olá!-MOI de Cas9v2 D2 5e6; d: Olá!-MOI de Cas9v2 D10 5e6; e: Lo-MOI de Cas9v2 D5 2.5e6.

Uma panóplia de genes envolvidos na infecção SARS-CoV-2

“Nós descobrimos os genes envolvidos nos processos biológicos diversos que incluem a cromatina que remodela, alteração do histone, sinalização celular, e o regulamento do RNA,” autores do estudo sublinha seus resultados principais no papel disponível no bioRxiv.

Os pesquisadores avaliaram 25 destes genes com único-guia individual RNAs em um formato posto, incluindo genes proviral e antivirosos, e localizaram os antagonistas pequenos da molécula que fornecem a protecção contra a infecção o SARS-CoV-2 e a morte celular subseqüente.

Em curto, os pesquisadores identificaram factores já conhecidos do anfitrião SARS-CoV-2 - incluindo o receptor ACE2 e a catepsina L do protease - mas igualmente genes proviral novos e caminhos. As descobertas recentes consistiram em uma cromatina específica que remodela os componentes complexos e cruciais caminho da sinalização do factor de crescimento de transformação do beta, que pertencem à superfamília de cytokines multifuncionais.

“Interessante, nós não detectamos diversos genes implicados previamente na infecção SARS-CoV-2 que inclui TMPRSS2, PIKFyve, e TPC2 que sugerem que estes genes sejam ou nao essenciais em uma maneira pilha-intrínseca de Vero ou que a redundância funcional existe com outros genes”, mais adicionais explicam autores do estudo.

Estude a caixa de grupo igualmente revelada 1 da alto-mobilidade do alarmin dos autores (HMGB1) como um componente-chave para a réplica SARS-CoV-2; inversamente, a perda de complexo do acompanhante do histone H3.3 aprontou as pilhas contaminadas à morte celular vírus-induzida.

Alvos potenciais do tratamento da revelacão

Destacando uma disposição de genes proviral e antivirosos do anfitrião, este estudo tem implicações substanciais para nossa compreensão da patogénese COVID-19, do tratamento, e do projecto vacinal - especialmente revelando alvos terapêuticos potenciais para SARS-CoV-2.

Mais especificamente, os genes e os caminhos que foram identificados neste estudo podem explicar a variação da apresentação da doença, que pode positivamente correlacionar com os genes de resistência, mas correlacionam negativamente com os genes da sensibilização em celular, no tecido, e no nível do organismo.

“É intrigante especular que a cromatina e os genes dealteração identificados aqui contribuem à expressão de um programa proviral heterogêneo da expressão genética que regule potencial ACE2 e outros genes de interacção virais”, dizem autores do estudo.

Em conclusão, este estudo representa a primeira tela genética genoma-larga executado com todo o coronavirus, com os resultados amplamente aplicáveis que podem alertar a revelação de tratamentos anfitrião-dirigidos contra tensões pandémicas actuais e futuras dos coronaviruses.

Rede de grupos do gene. Os nós representam grupos significativamente enriquecidos do gene. O tamanho de cada grupo do gene é proporcional a sua z-contagem absoluta média. Os grupos do gene são coloridos pelo sentido em que marcam. As bordas representam a sobreposição significativa entre grupos do gene. A transparência de cada borda é proporcional à fracção dos genes compartilhados por dois grupos do gene. Os grupos do gene foram aglomerados usando o algoritmo do infomap e o grupo o mais central por PageRank é etiquetado para cada conjunto. O algoritmo de Fruchterman-Reingold foi usado para apresentar a rede.
A rede de grupos do gene. Os nós representam grupos significativamente enriquecidos do gene. O tamanho de cada grupo do gene é proporcional a sua z-contagem absoluta média. Os grupos do gene são coloridos pelo sentido em que marcam. As bordas representam uma sobreposição significativa entre grupos do gene. A transparência de cada borda é proporcional à fracção dos genes compartilhados por dois grupos do gene. Os grupos do gene foram aglomerados usando o algoritmo do infomap e o grupo o mais central por PageRank é etiquetado para cada conjunto. O algoritmo de Fruchterman-Reingold foi usado para apresentar a rede.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Tomislav Meštrović

Written by

Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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