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La primera pantalla genoma-ancha de CRISPR revela los genes que controlan la infección SARS-CoV-2

Realizando una pantalla genoma-ancha de CRISPR en el coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática, los investigadores de los E.E.U.U. determinaron genes proviral nuevos y caminos, y destacaron los genes del ordenador principal que pueden regular la patogenesia de la enfermedad del coronavirus (COVID-19), así como los objetivos potenciales que revelaban para las aproximaciones nuevas del tratamiento. Sus conclusión están actualmente disponibles en el servidor de la prueba preliminar del bioRxiv*.

Pues no hay vacunas o terapéutica aprobada actualmente disponible para el control de enfermedades, el pandémico en curso de COVID-19 representa un riesgo importante para los sistemas de la salud pública en todo el mundo. Esto se puede ampliar a otros coronaviruses emergentes, que hemos encontrado ya (por ejemplo los SARS-CoV y el MERS-CoV originales), o a los que plantean una amenaza para el futuro.

El asiento de SARS-CoV-2 (es decir, el agente causativo de la enfermedad COVID-19) en la célula representa el primer paso en su ciclo vital, que es mediado por la proteína viral del pico que ata a la enzima angiotensina-que convierte 2 (ACE2) del receptor de la superficie de la célula. Este último es un determinante importante del alcance del ordenador principal y del tropismo de la célula.

Sin embargo, una segunda acción proteolítica se autoriza para exponer el péptido viral de la fusión y habilitar la fusión de la membrana. Esto puede ocurrir en la membrana de plasma de la célula de objetivo por el serina-tipo 2 (TMPRSS2) de la proteasa de la transmembrana o en el endosome por la catepsina L.

Después de la fusión de la membrana viral, el material genético viral se libera en el citoplasma de células humanas; allí, se traduce y establece complejos virales de la réplica y de la transcripción antes de la reunión y de florecer. No obstante, los genes del ordenador principal que median estos procesos siguen siendo evasivos.

No obstante, la identificación de los factores del ordenador principal que habilitan el proceso de la infección es de la importancia extrema para informar a mecanismos de la patogenesia COVID-19, revela variaciones de la susceptibilidad del ordenador principal, pero también para determinar nuevas terapias ordenador principal-dirigidas con eficacia amplia.

Por lo tanto, para destapar los genes del ordenador principal necesarios para la infección SARS-CoV-2 y la muerte celular, los investigadores de Yale, Massachusetts Institute of Technology, Harvard, la Facultad de Medicina de Icahn, y la Universidad de Texas generaron una biblioteca totalmente nueva de CRISPR y persiguieron la primera pantalla genoma-ancha de CRISPR con SARS-CoV-2.

Un esfuerzo genoma-ancho de la investigación

Para determinar los genes del ordenador principal imprescindibles para la supervivencia de la célula en respuesta a SARS-CoV-2, este grupo de investigadores decidía utilizar la variedad de células Vero-E6 de la grapa verde africana, que es altamente favorable a la infección SARS-CoV-2 y a los efectos citopáticos inducidos por virus.

Por lo tanto, han realizado dos esfuerzos genoma-anchos independientes de la investigación usando una biblioteca reunida genoma-ancha de CRISPR comprendida 83.963 de la única guía de alcance RNAs, con un promedio cuatro de la única guía RNAs por gen, y mil único-guías de no-alcance RNAs del mando.

La identificación exacta de los genes proviral sabidos ACE2 y de la catepsina L demostró la calidad técnica de la pantalla, proveyendo de confianza en encontrar los genes adicionales la propensión a regular la infección SARS-CoV-2.

Como prueba-de-principio, los investigadores también probaron varios pequeños inhibidores de la molécula, que dieron lugar a la identificación de tres moléculas que tenían la capacidad de inhibir la réplica SARS-CoV-2 y la muerte celular inducida por virus subsiguiente.

la pantalla Genoma-ancha de CRISPR determina los genes críticos para la muerte celular de SARS-CoV-2-induced. (a) Diagrama esquemático de la pantalla reunida. Las células Vero-E6 que expresaban Cas9 transduced con la biblioteca genoma-ancha del sabaeus de la C. vía lentivirus. La población transduced de la célula después recibió un tratamiento falso o fue desafiada con SARS-CoV-2 bajo diversas condiciones de la cultura. Las células de la supervivencia de cada condición fueron aisladas y las series del sgRNA fueron amplificadas por la polimerización en cadena y ordenadas. (b) Gráfico del volcán que muestra resistencia que consulta y sensibilidad de los genes superiores a SARS-CoV-2. La z-muesca del gen-nivel y - log10 (FDR) eran ambos calculados usando el medio de las cinco condiciones Cas9-v2. No-apuntando sgRNAs del mando fueron agrupados aleatoriamente en equipos de 4 para servir como genes “simulados” y se muestran en verde. (c) Funcionamiento de la guía individual RNAs que apunta ACE2, SMARCA4, CTSL, y TMPRSS2. La residual media a través de las cinco condiciones Cas9-v2 se traza para la biblioteca completa (capota) y para 4 la guía RNAs que apunta cada gen. (d) Heatmaps de los 25 golpes superiores del gen para la resistencia y la sensibilidad, alineados por la z-muesca media en las condiciones Cas9-v2.Los genes que se incluyen en uno de los equipos del gen etiqueta hacia adentro (higo 2A) se colorean por consiguiente. Condicione a: Hola-MOI de Cas9v2 D5 2.5e6; b: Hola-MOI de Cas9v2 D5 5e6; c: Hola-MOI de Cas9v2 D2 5e6; d: Hola-MOI de Cas9v2 D10 5e6; e: Lo-MOI de Cas9v2 D5 2.5e6.
la pantalla Genoma-ancha de CRISPR determina los genes críticos para la muerte celular de SARS-CoV-2-induced. (a) Diagrama esquemático de la pantalla reunida. Las células Vero-E6 que expresaban Cas9 transduced con la biblioteca genoma-ancha del sabaeus de la C. vía lentivirus. La población transduced de la célula que o recibida un tratamiento falso o fue desafiada con SARS-CoV-2 bajo diversas condiciones de la cultura. Las células de la supervivencia de cada condición fueron aisladas y las series del sgRNA fueron amplificadas por la polimerización en cadena y ordenadas. (b) Gráfico del volcán que muestra resistencia que consulta y sensibilidad de los genes superiores a SARS-CoV-2. La z-muesca del gen-nivel y - log10 (FDR) eran ambos calculados usando el medio de las cinco condiciones Cas9-v2. No-apuntando sgRNAs del mando fueron agrupados aleatoriamente en equipos de 4 para servir como genes “simulados” y se muestran en verde. (c) Funcionamiento de la guía individual RNAs que apunta ACE2, SMARCA4, CTSL, y TMPRSS2. La residual media a través de las cinco condiciones Cas9-v2 se traza para la biblioteca completa (capota) y para 4 la guía RNAs que apunta cada gen. (d) Heatmaps de los 25 genes superiores pegados para la resistencia y la sensibilidad, alineado por la z-muesca media en las condiciones Cas9-v2. Los genes que se incluyen en uno de los equipos del gen etiqueta hacia adentro (higo 2A) se colorean por consiguiente. Condicione a: Hola-MOI de Cas9v2 D5 2.5e6; b: Hola-MOI de Cas9v2 D5 5e6; c: Hola-MOI de Cas9v2 D2 5e6; d: Hola-MOI de Cas9v2 D10 5e6; e: Lo-MOI de Cas9v2 D5 2.5e6.

Una panoplia de genes implicados en la infección SARS-CoV-2

“Descubrimos los genes implicados en los procesos biológicos diversos incluyendo la cromatina que remodelaba, modificación de la histona, transmisión de señales celular, y la regla del ARN,” los autores del estudio acentúa sus conclusión principales en el papel disponible en bioRxiv.

Los investigadores han fijado 25 de estos genes con la único-guía individual RNAs en un formato puesto en orden, incluyendo genes proviral y antivirus, y han establecido claramente a los pequeños antagonistas de la molécula que proveen de la protección contra la infección SARS-CoV-2 y muerte celular subsiguiente.

En fin, los investigadores determinaron factores ya sabidos del ordenador principal SARS-CoV-2 - incluyendo el receptor ACE2 y la catepsina L de la proteasa - pero también genes proviral nuevos y caminos. Los descubrimientos recientes consistieron en una cromatina específica que remodelaba los componentes complejos y cruciales del camino beta de la transmisión de señales del factor de incremento de transformación, que pertenecen a la superfamilia de cytokines multifuncionales.

“Interesante, no descubrimos varios genes implicados previamente en la infección SARS-CoV-2 incluyendo TMPRSS2, PIKFyve, y TPC2 que sugieren que estos genes sean o no esenciales de una manera célula-intrínseca de Vero o que la redundancia funcional existe con otros genes”, más futuros explican a autores del estudio.

Estudie la caja de grupo también revelada de la alto-movilidad del alarmin de los autores 1 (HMGB1) como componente clave para la réplica SARS-CoV-2; inversamente, la baja del complejo de la señora de compañía de la histona H3.3 preparó las células infectadas a la muerte celular inducida por virus.

Objetivos potenciales del tratamiento de la revelación

Destacando un arsenal de genes proviral y antivirus del ordenador principal, este estudio tiene implicaciones sustanciales para nuestra comprensión de la patogenesia COVID-19, del tratamiento, y del diseño vaccíneo - especialmente revelando los objetivos terapéuticos potenciales para SARS-CoV-2.

Más concretamente, los genes y los caminos que fueron determinados en este estudio pueden explicar la variación de la presentación de la enfermedad, que puede correlacionar positivo con los genes de resistencia, pero correlacionan negativo con los genes de la sensibilización en celular, tejido, y nivel del organismo.

“Es intrigante especular que la cromatina y los genes de histona-modificación determinados aquí contribuyen a la expresión de un programa proviral heterogéneo de la expresión génica que potencialmente regule ACE2 y otros genes que obran recíprocamente virales”, dicen a autores del estudio.

En conclusión, este estudio representa la primera pantalla genética genoma-ancha realizado con cualquier coronavirus, con las conclusión ampliamente aplicables que pueden incitar el revelado de tratamientos ordenador principal-dirigidos contra deformaciones pandémicas actuales y futuras de coronaviruses.

Red de los equipos del gen. Los nodos representan equipos importante enriquecidos del gen. La talla de cada equipo del gen es proporcional a su z-muesca absoluta media. Los equipos del gen son coloreados por la dirección en la cual rayan. Los filos representan recubrimiento importante entre los equipos del gen. La diapositiva de cada filo es proporcional a la fracción de los genes compartidos por dos equipos del gen. Los equipos del gen fueron agrupados usando el algoritmo del infomap y el equipo más central por PageRank etiqueta para cada atado. El algoritmo de Fruchterman-Reingold fue utilizado para presentar la red.
La red de los equipos del gen. Los nodos representan equipos importante enriquecidos del gen. La talla de cada equipo del gen es proporcional a su z-muesca absoluta media. Los equipos del gen son coloreados por la dirección en la cual rayan. Los filos representan un recubrimiento importante entre los equipos del gen. La diapositiva de cada filo es proporcional a la fracción de los genes compartidos por dos equipos del gen. Los equipos del gen fueron agrupados usando el algoritmo del infomap y el equipo más central por PageRank etiqueta para cada atado. El algoritmo de Fruchterman-Reingold fue utilizado para presentar la red.

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
Dr. Tomislav Meštrović

Written by

Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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