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Le modèle structuré de « découpage et déplacement » active le développement profilé des sondes moléculaires SARS-CoV-2

Une étude séminale par des chercheurs des USA, actuellement disponibles sur le serveur de prétirage de bioRxiv*, explique comment le modèle basé sur structure peut être efficacement utilisé pour développer des sondes moléculaires visant la pointe du coronavirus 2 de syndrôme respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) et ses domaines, avec la future utilisation possible dans la diagnose, la demande de règlement et la mise au point de vaccin.

L'émergence d'un coronavirus nouveau SARS-CoV-2 en Chine s'est rapidement transformée en pandémie globale de la maladie de coronavirus (COVID-19). Au moment où, il n'y a aucun vaccin approuvé ou thérapeutique visée pour la demande de règlement de cette maladie, alors que les tests diagnostique tâchent toujours de réaliser la sensibilité et la spécificité optimales.

D'autre part, les études structurelles principales du virus progressent à un rythme sans précédent. Il est déjà réputé que la glycoprotéine de la pointe SARS-CoV-2 (S-protéine) introduise l'entrée de cellules et est l'objectif principal de la réaction sérologique, particulièrement son domaine récepteur-grippant (RBD) ; aussi, le virus emploie l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2) comme récepteur cellulaire.

Micrographe électronique nouveau de lecture du coronavirus SARS-CoV-2 Colorized d
Micrographe électronique nouveau de lecture du coronavirus SARS-CoV-2 Colorized d'une cellule d'apoptotique (vert) fortement infectée avec des particules du virus SARS-COV-2 (pourprées), d'isolement dans un échantillon patient. Image saisie à l'installation intégrée par NIAID de recherches (IRF) dans le fort Detrick, le Maryland. Crédit : NIAID

La promesse des sondes moléculaires

Les sondes moléculaires avec l'affinité pour les objectifs clés de certains virus peuvent être d'installation grande. Elles peuvent servir de balises moléculaires pour faciliter l'identification des anticorps efficaces pour le traitement passif ; supplémentaire, elles peuvent être utilisées pour évaluer la réactivité de sérums et pour obtenir les bornes sensibles de l'infection, mais également pour définir et surveiller des réactions obtenues requises pour la mise au point de vaccin.

Comme résultat, biotine-marqué les sondes moléculaires qui comportent des régions spécifiques de la S-protéine SARS-CoV-2 (c.-à-d., un objectif viral principal pour l'anticorps de neutralisation) peut en effet être très utile dans l'isolement et la caractérisation des anticorps qui visent cet agent pathogène neuf apparu.

Un organisme de recherche de l'institut national des USA de l'allergie et les maladies infectieuses, l'Université de Columbia, le laboratoire national de Frederick pour la cancérologie, et l'université du Kansas a décrit le modèle basé sur structure des sondes moléculaires, de la pointe SARS-CoV-2 entourante et de ses domaines.

Stratégie pour la purification Basée sur balise avec le modèle schématique de Biotinylation de Sur-Fléau (a) du construire d
Stratégie pour la purification Basée sur balise avec le modèle schématique de Biotinylation de Sur-Fléau (a) du construire d'expression avec des sondes moléculaires SARS-CoV-2. Un domaine continuel d'Ig d'être humain à chaîne unique (scFc) a été ajouté au terminus de N pour faciliter l'expression et la purification. La balise d'AVI a été mise au terminus de C après un lieur de l'acide aminé 10 pour le biotinylation. Les flèches rouges dans les deuxièmes et quatrièmes domaines de Fc ont montré que les mutations de « poignée-dans-trou » évitaient la dimérisation du scFc. (b) Digestion de Biotinylation et de HRV3C. Le surnageant de culture cellulaire de la transfecté de cellules transitoirement avec le plasmide a été chargé sur le fléau d'affinité de la protéine A. Des réactions de clivage de Biotinylation et de HRV3C peuvent être effectuées en série ou simultanément, car les tampons pour les deux réactions sont compatibles.

Trimère stabilisé de la pointe SARS-CoV-2 avec le biotinylation

Pour la construction de sonde, les chercheurs ont employé un procédé qui a comporté l'ensemble de « découpage et déplacement » des composantes obligatoires, utilisant une balise de purification de N-terminal et des extensions de séquence visées par des enzymes de séquence-détail.

Plus particulièrement, les chercheurs ont conçu la première fois un élément qui a tenu compte du biotinylation basé sur balise de purification et de sur-fléau (ce dernier étant un procédé de fixer en covalence la biotine à une protéine). Ensuite, ils ont comporté l'ectodomain de la pointe SARS-CoV-2 avec des mutations de prefusion et AC stabilisants - motif terminal de trimerization.

Toutes les sondes ont été caractérisées pour l'antigénicité et la reconnaissance de récepteur ACE2, et la structure de la sonde d'ectodomain de pointe a été supplémentaire déterminée par microscopie de cryo-électron. des spécificités et les capacités Anticorps-grippantes de cellule-trier des sondes biotinylated ont été également caractérisées en détail.

« Nous avions l'habitude également la structure du domaine obligatoire de récepteur recombiné avec ACE2 pour définir les mutations qui pourraient empêcher l'interaction ACE2, que nous avons comportée aux sondes du mutant RBD avec ACE2-recognition enlevées », auteurs d'étude expliquons davantage leur approche.

En conclusion, ils ont caractérisé les propriétés complémentaires des sondes conçues - comprenant le degré de biotinylation et d'utilisation potentielle en triant des cellules de levure exprimant les anticorps SARS-CoV-2 ou les lymphocytes B pointe-grippants des donneurs COVID-19 convalescents.

Définition Basée sur structure des sondes moléculaires SARS-CoV-2 comportant NTD, RBD et RBDSD1 la structure de Cryo-FIN DE SUPPORT des domaines (a) du domaine de NTD dans la sonde de S2P déterminée dans cette étude (figure 3E), avec la densité de reconstruction montrée dans l
Définition Basée sur structure des sondes moléculaires SARS-CoV-2 comportant NTD, RBD et RBDSD1 la structure de Cryo-FIN DE SUPPORT des domaines (a) du domaine de NTD dans la sonde de S2P déterminée dans cette étude (figure 3E), avec la densité de reconstruction montrée dans l'orange pour le domaine de NTD, et le gris autrement. Le premier a commandé le résidu avec la densité (A27) est mis en valeur avec une sphère bleue ; le dernier résidu du domaine de NTD (S305) est mis en valeur avec une sphère rouge. (b) Vue en gros plan des terminus de NTD. (c) Séquence de sonde de domaine de NTD. La séquence est mise en valeur dans l'orange excepté les résidus 14-26, qui sont désordonnés dans les structures cryo-FIN DE SUPPORT. (d) Structure Cryo-FIN DE SUPPORT du domaine de RBD dans la pointe (figure 3E), avec la densité de reconstruction montrée dans bleu-vert pour le domaine de RBD, et gris autrement. Le premier résidu avec la densité (L329) est mis en valeur avec une sphère bleue ; durez a commandé le résidu du domaine de RBD (G526) est mis en valeur avec une sphère rouge. (e) Vue en gros plan des terminus de la pointe RBD. (f) Séquence de la sonde de domaine de RBD mise en valeur dans bleu-vert. Structure de Cryo-FIN DE SUPPORT de (G) des domaines RBD-SD1 dans la pointe (figure 3E), avec la densité de reconstruction montrée dans le vert pour le domaine RBD-SD1, et gris autrement. Le premier résidu avec la densité (R319) est mis en valeur avec une sphère bleue ; durez a commandé le résidu du domaine RBD-SD1 (S591) est mis en valeur avec une sphère rouge. (h) Vue en gros plan des terminus de la pointe RBD-SD1. (i) Séquence de la sonde du domaine RBD-SD1 mise en valeur en vert.

Vers le développement profilé des sondes moléculaires

Totalement, ce type de modèle basé sur structure (accouplé aux procédés efficaces de purification et de biotinylation) peut activer le développement profilé des sondes de la pointe-ectodomain SARS-CoV-2. Comme expliqué dans cette étude, leurs propriétés ont laissé entendre que de telles sondes sont réellement un bon imitateur biologique de l'ectodomain de pointe du prefusion SARS-CoV-2.

« Les méthodes basées sur structure que nous décrivons ici pour la construction de sonde peuvent tenir compte de l'évaluation des réactions immunitaires d'autres machines de fusion de type 1 », disent des auteurs d'étude. Elles ajoutent également que les sondes tronquées de domaine se sont pliées correctement et ont préservé la conformation indigène.

« De façon générale, le modèle basé sur structure de découpage et déplacement décrit ici devrait être facilement adapté au développement profilé des sondes moléculaires contre non seulement ces agents pathogènes, mais les agents pathogènes apparaissants également, comme montrés ici pour SARS-CoV-2 », concluent des auteurs d'étude.

Le modèle de sonde peut être considéré un inducteur apparaissant qui a expliqué sa signification dans d'autres opérations de avis vers le médicament personnalisé. Car COVID-19 montre la variation individuelle considérable dans la présentation clinique, l'approche personnalisée est de plus en plus importante.

Avis *Important

le bioRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée.

Journal reference:
  • Zhou, T. et al. (2020). Structure-Based Design with Tag-Based Purification and In-Process Biotinylation Enable Streamlined Development of SARS-CoV-2 Spike Molecular Probes. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2020.06.22.166033.
Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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