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La progettazione strutturata “di taglia incolla„ permette allo sviluppo aerodinamico delle sonde molecolari SARS-CoV-2

Uno studio seminale dai ricercatori degli Stati Uniti, attualmente disponibili sul " server " della pubblicazione preliminare del bioRxiv*, dimostra come a progettazione basata a struttura può essere impiegata efficientemente per sviluppare le sonde molecolari che mirano alla punta di coronavirus 2 di sindrome respiratorio acuto severo (SARS-CoV-2) ed ai sui domini, con uso futuro possibile nei sistemi diagnostici, nel trattamento e nello sviluppo del vaccino.

L'emergenza di un coronavirus novello SARS-CoV-2 in Cina si è trasformata in rapidamente una pandemia globale della malattia di coronavirus (COVID-19). Dal momento che, non c'è vaccini approvati o terapeutica mirata a per il trattamento di questa malattia, mentre i test diagnostici ancora stanno sforzando di raggiungere la sensibilità e la specificità ottimali.

D'altra parte, gli studi strutturali fondamentali del virus stanno progredendo ad un passo senza precedenti. È già ben noto che la glicoproteina della punta SARS-CoV-2 (S-proteina) promuove l'entrata delle cellule ed è l'obiettivo principale della risposta sierologica, particolarmente il suo dominio dell'ricevitore-associazione (RBD); anche, il virus usa l'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2) come recettore cellulare.

Microscopio elettronico a scansione novello di Coronavirus SARS-CoV-2 Colorized di una cella apoptotic (verde) infettata molto con le particelle del virus SARS-COV-2 (porpora), isolate da un campione paziente. L
Microscopio elettronico a scansione novello di Coronavirus SARS-CoV-2 Colorized di una cella apoptotic (verde) infettata molto con le particelle del virus SARS-COV-2 (porpora), isolate da un campione paziente. Immagine catturata alla funzione di ricerca integrata NIAID (IRF) in Detrick forte, Maryland. Credito: NIAID

La promessa delle sonde molecolari

Le sonde molecolari con l'affinità per gli obbiettivi chiave dei virus sicuri possono essere di vasta utilità. Possono servire da tag molecolari facilitare l'identificazione di efficaci anticorpi per la terapia passiva; ulteriormente, possono essere utilizzate per valutare la reattività dei sieri e per ottenere gli indicatori sensibili dell'infezione, ma anche per definire e riflettere le risposte suscitate state necessarie per sviluppo del vaccino.

Di conseguenza, biotina-contrassegnato sonde molecolari che comprendono le regioni specifiche SARS-CoV-2 la S-proteina (cioè, un obiettivo virale principale per l'anticorpo di neutralizzazione) può effettivamente essere molto utile nell'isolamento e nella caratterizzazione degli anticorpi che mirano a questo agente patogeno recentemente emergente.

Un gruppo di ricerca dall'istituto nazionale degli Stati Uniti dell'allergia e malattie infettive, Columbia University, laboratorio nazionale di Frederick per ricerca sul cancro e l'università di Kansas ha descritto alla la progettazione basata a struttura delle sonde molecolari, della punta d'inclusione SARS-CoV-2 e dei sui domini.

Strategia per a depurazione Basata a tag con progettazione schematica di Biotinylation della Su Colonna (A) della costruzione di espressione delle sonde molecolari SARS-CoV-2. Un dominio costante di Ig dell
Strategia per a depurazione Basata a tag con progettazione schematica di Biotinylation della Su Colonna (A) della costruzione di espressione delle sonde molecolari SARS-CoV-2. Un dominio costante di Ig dell'essere umano a catena semplice (scFc) si è aggiunto all'estremità di N per facilitare l'espressione e la depurazione. Il tag di AVI è stato collocato all'estremità di C dopo un linker acido amminico 10 per il biotinylation. Le frecce rosse nei secondi e quarti domini di Fc hanno mostrato le mutazioni “del perno-in-foro„ per impedire la dimerizzazione dello scFc. (B) digestione di HRV3C e di Biotinylation. Il galleggiante della coltura cellulare dalle celle transfected transitoriamente con il plasmide è stato caricato sulla colonna di affinità della proteina A. Le reazioni di fenditura di HRV3C e di Biotinylation possono essere effettuate in serie o simultaneamente, poichè i buffer per entrambe le reazioni sono compatibili.

Trimero stabilizzato della punta SARS-CoV-2 con il biotinylation

Per la costruzione della sonda, i ricercatori hanno usato un trattamento che ha compreso il montaggio “di taglia incolla„ delle componenti obbligatorie, impiegando un tag di depurazione del N-terminale e gli allungamenti di sequenza mirati a dagli enzimi sequenza-specifici.

Più specificamente, i ricercatori in primo luogo hanno progettato una costruzione che ha tenuto conto al il biotinylation basato a tag della su colonna e di depurazione (l'ultimo che è un trattamento in covalenza di fissare biotina ad una proteina). Dopo, hanno compreso il ectodomain della punta SARS-CoV-2 con le mutazioni di prefusion e la corrente alternata di stabilizzazione - motivo terminale di trimerization.

Tutte le sonde sono state caratterizzate per antigenicità ed il riconoscimento di ricevitore ACE2 e la struttura della sonda del ectodomain della punta è stata determinata ulteriormente mediante microscopia dell'cryo-elettrone. le specificità dell'Anticorpo-associazione e le capacità dell'cella-ordinamento delle sonde biotinylated egualmente sono state caratterizzate dettagliatamente.

“Egualmente abbiamo usato la struttura del dominio obbligatorio del ricevitore recombinante con ACE2 per definire le mutazioni che potrebbero inibire l'interazione ACE2, che abbiamo compreso nelle sonde del mutante RBD con ACE2-recognition rimosse„, autori di studio più ulteriormente spieghiamo il loro approccio.

Per concludere, hanno caratterizzato i beni supplementari delle sonde inventate - compreso il grado di biotinylation e di uso potenziale nell'ordinamento delle celle di lievito che esprimono gli anticorpi o i linfociti B dell'punta-associazione SARS-CoV-2 dai donatori convalescenti COVID-19.

A definizione Basata a struttura delle sonde molecolari SARS-CoV-2 che comprendono la struttura Cryo-EM NTD, RBD e RBDSD1 dei domini (A) il dominio di NTD nella sonda di S2P determinata in questo studio (figura 3E), con densità di ricostruzione indicata altrimenti in arancia per il dominio di NTD ed il gray. Il primo ha ordinato il residuo con densità (A27) è evidenziato con una sfera blu; l
A definizione Basata a struttura delle sonde molecolari SARS-CoV-2 che comprendono la struttura Cryo-EM NTD, RBD e RBDSD1 dei domini (A) il dominio di NTD nella sonda di S2P determinata in questo studio (figura 3E), con densità di ricostruzione indicata altrimenti in arancia per il dominio di NTD ed il gray. Il primo ha ordinato il residuo con densità (A27) è evidenziato con una sfera blu; l'ultimo residuo di dominio di NTD (S305) è evidenziato con una sfera rossa. (B) visualizzazione del primo piano delle estremità di NTD. (C) sequenza della sonda del dominio di NTD. La sequenza è evidenziata in arancia eccezione fatta per i residui 14-26, che sono disordinati nelle strutture cryo-EM. (D) struttura di Cryo-EM del dominio di RBD nella punta (figura 3E), con densità di ricostruzione indicata altrimenti in ciano per il dominio di RBD e gray. Il primo residuo con densità (L329) è evidenziato con una sfera blu; duri ha ordinato il residuo di dominio di RBD (G526) è evidenziato con una sfera rossa. (E) visualizzazione del primo piano delle estremità della punta RBD. (F) sequenza della sonda del dominio di RBD evidenziata in ciano. (G) struttura di Cryo-EM dei domini RBD-SD1 nella punta (figura 3E), con densità di ricostruzione indicata altrimenti nel verde per il dominio RBD-SD1 e gray. Il primo residuo con densità (R319) è evidenziato con una sfera blu; duri ha ordinato il residuo RBD-SD1 di dominio (S591) è evidenziato con una sfera rossa. (H) visualizzazione del primo piano delle estremità della punta RBD-SD1. (i) Sequenza della sonda del dominio RBD-SD1 evidenziata nel verde.

Verso lo sviluppo aerodinamico delle sonde molecolari

Complessivamente, questo tipo adi progettazione basata a struttura (accoppiata ai trattamenti efficienti di biotinylation e di depurazione) può permettere allo sviluppo aerodinamico delle sonde della punta-ectodomain SARS-CoV-2. Come dimostrato in questo studio, i loro beni hanno suggerito che tali sonde sono realmente un buon mimo biologico del ectodomain della punta di prefusion SARS-CoV-2.

“Ai i metodi che basati a struttura descriviamo qui per la costruzione della sonda possono tenere conto la valutazione delle risposte immunitarie di altri commputer di fusione di tipo 1„, dicono gli autori di studio. Egualmente aggiungono che le sonde tronche del dominio profilatura correttamente ed hanno conservato la conformazione indigena.

“In generale, alla la progettazione basata a struttura di taglia incolla descritta qui dovrebbe adattarsi facilmente allo sviluppo aerodinamico delle sonde molecolari contro non solo questi agenti patogeni, ma gli agenti patogeni anche emergenti, come indicati qui per SARS-CoV-2„, concludono gli autori di studio.

La progettazione della sonda può essere considerata un campo di emergenza che ha dimostrato il suo significato a punti ulteriori d'informazione verso medicina personale. Poichè COVID-19 mostra la variazione determinata sostanziale nella presentazione clinica, l'approccio individualizzato è sempre più importante.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
  • Zhou, T. et al. (2020). Structure-Based Design with Tag-Based Purification and In-Process Biotinylation Enable Streamlined Development of SARS-CoV-2 Spike Molecular Probes. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2020.06.22.166033.
Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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