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O projecto estruturado do “cortado e colado” permite revelação aerodinâmica das pontas de prova SARS-CoV-2 moleculars

Um estudo seminal pelos pesquisadores dos E.U., actualmente disponíveis no server da pré-impressão do bioRxiv*, demonstra como o projecto estrutura-baseado pode eficientemente ser empregado para desenvolver as pontas de prova moleculars que visam o ponto do coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) e seus domínios, com uso futuro possível nos diagnósticos, no tratamento e na revelação vacinal.

A emergência de um coronavirus novo SARS-CoV-2 em China transformou rapidamente em uma pandemia global da doença do coronavirus (COVID-19). No momento em que, não há nenhuma vacina aprovada ou terapêutica visada para o tratamento desta doença, quando os testes de diagnóstico ainda se esforçarem para conseguir a sensibilidade e a especificidade óptimas.

Por outro lado, os estudos estruturais fundamentais do vírus estão progredindo em um ritmo inaudito. É já conhecido que a glicoproteína do ponto SARS-CoV-2 (S-proteína) promove a entrada da pilha e é o alvo principal da resposta serologic, especialmente seu domínio receptor-obrigatório (RBD); também, o vírus usa a angiotensin-conversão da enzima 2 (ACE2) como um receptor da pilha.

Micrografia de elétron nova da exploração de Coronavirus SARS-CoV-2 Colorized de uma pilha apoptotic (verde) contaminada pesadamente com as partículas do vírus SARS-COV-2 (roxas), isoladas de uma amostra paciente. A imagem capturada no NIAID integrou a instalação de investigação no forte Detrick, Maryland. Crédito: NIAID
Micrografia de elétron nova da exploração de Coronavirus SARS-CoV-2 Colorized de uma pilha apoptotic (verde) contaminada pesadamente com as partículas do vírus SARS-COV-2 (roxas), isoladas de uma amostra paciente. Imagem capturada na instalação de investigação integrada NIAID (IRF) no forte Detrick, Maryland. Crédito: NIAID

A promessa de pontas de prova moleculars

As pontas de prova moleculars com a afinidade para os alvos chaves de determinados vírus podem ser do serviço público largo. Podem servir como etiquetas moleculars para facilitar a identificação de anticorpos eficazes para a terapia passiva; adicionalmente, podem ser utilizados para avaliar a reactividade dos soros e para obter marcadores sensíveis da infecção, mas para definir e monitorar igualmente as respostas induzidas necessários para a revelação vacinal.

Em conseqüência, biotina-etiquetado as pontas de prova moleculars que compreendem regiões específicas da S-proteína SARS-CoV-2 (isto é, um alvo viral principal para o anticorpo da neutralização) pode certamente ser muito útil no isolamento e na caracterização dos anticorpos que visam este micróbio patogénico recentemente emerso.

Um grupo de investigação do instituto nacional dos E.U. da alergia e doenças infecciosas, Universidade de Columbia, laboratório nacional de Frederick para a investigação do cancro, e a universidade de Kansas descreveu o projecto estrutura-baseado de pontas de prova moleculars, do ponto SARS-CoV-2 de cerco e dos seus domínios.

Estratégia para a purificação Etiqueta-Basear com projecto esquemático de Biotinylation da Em-Coluna (a) da construção da expressão das pontas de prova SARS-CoV-2 moleculars. Um domínio constante de Ig do único ser humano chain (scFc) foi adicionado no término de N para facilitar a expressão e a purificação. A etiqueta de AVI foi colocada no término de C após um amino linker 10 ácido para o biotinylation. As setas vermelhas nos segundos e quartos domínios de Fc mostraram as mutações do “botão-em-furo” para impedir o dimerization do scFc. (b) Digestão de Biotinylation e de HRV3C. O supernatant da cultura celular das pilhas transfected transiente com plasmídeo foi carregado na coluna de afinidade da proteína A. As reacções de segmentação de Biotinylation e de HRV3C podem ser realizadas em série ou simultaneamente, porque os amortecedores para ambas as reacções são compatíveis.
Estratégia para a purificação Etiqueta-Basear com projecto esquemático de Biotinylation da Em-Coluna (a) da construção da expressão das pontas de prova SARS-CoV-2 moleculars. Um domínio constante de Ig do único ser humano chain (scFc) foi adicionado no término de N para facilitar a expressão e a purificação. A etiqueta de AVI foi colocada no término de C após um amino linker 10 ácido para o biotinylation. As setas vermelhas nos segundos e quartos domínios de Fc mostraram as mutações do “botão-em-furo” para impedir o dimerization do scFc. (b) Digestão de Biotinylation e de HRV3C. O supernatant da cultura celular das pilhas transfected transiente com plasmídeo foi carregado na coluna de afinidade da proteína A. As reacções de segmentação de Biotinylation e de HRV3C podem ser realizadas em série ou simultaneamente, porque os amortecedores para ambas as reacções são compatíveis.

Trimer estabilizado do ponto SARS-CoV-2 com biotinylation

Para a construção da ponta de prova, os pesquisadores usaram um processo que incorporasse o conjunto do “cortado e colado” de componentes obrigatórios, empregando uma etiqueta da purificação do N-terminal e os estiramentos da seqüência visados por enzimas seqüência-específicas.

Mais especificamente, os pesquisadores projectaram primeiramente uma construção que permitisse o biotinylation etiqueta-baseado da purificação e da em-coluna (o último que é um processo covalently de anexar a biotina a uma proteína). Em seguida, incorporaram o ectodomain do ponto SARS-CoV-2 com mutações do prefusion e corrente alternada de estabilização - motivo terminal do trimerization.

Todas as pontas de prova foram caracterizadas para a antigenitura e o reconhecimento de receptor ACE2, e a estrutura da ponta de prova do ectodomain do ponto foi determinada adicionalmente pela microscopia do cryo-elétron. as especificidades e as capacidades Anticorpo-obrigatórias da pilha-classificação das pontas de prova biotinylated foram caracterizadas igualmente em detalhe.

“Nós igualmente usamos a estrutura de domínio obrigatório do receptor de recombinação com ACE2 para definir as mutações que poderiam inibir a interacção ACE2, que nós incorporamos nas pontas de prova do mutante RBD com ACE2-recognition retiradas”, autores do estudo explicamos mais sua aproximação.

Finalmente, caracterizaram propriedades adicionais das pontas de prova planejadas - incluindo o grau de biotinylation e de uso potencial em classificar as pilhas de fermento que expressam os anticorpos SARS-CoV-2 ou B-pilhas ponto-obrigatórias dos doadores COVID-19 convalescentes.

Definição Estrutura-Baseada das pontas de prova SARS-CoV-2 moleculars que compreendem a estrutura do Cryo-EM NTD, RBD e RBDSD1 dos domínios (a) do domínio de NTD na ponta de prova de S2P determinada neste estudo (figura 3E), com a densidade da reconstrução mostrada na laranja para o domínio de NTD, e o cinza de outra maneira. O primeiro pediu o resíduo com densidade (A27) é destacado com uma esfera azul; o último resíduo do domínio de NTD (S305) é destacado com uma esfera vermelha. (b) Ideia do close-up dos términos de NTD. (c) Seqüência da ponta de prova do domínio de NTD. A seqüência é destacada na laranja à exceção dos resíduos 14-26, que são desorganizado nas estruturas cryo-EM. (d) Estrutura Cryo-EM do domínio de RBD no ponto (figura 3E), com a densidade da reconstrução mostrada em ciano para o domínio de RBD, e cinza de outra maneira. O primeiro resíduo com densidade (L329) é destacado com uma esfera azul; dure pediu o resíduo do domínio de RBD (G526) é destacado com uma esfera vermelha. (e) Ideia do close-up dos términos do ponto RBD. (f) Seqüência da ponta de prova do domínio de RBD destacada em ciano. (g) Estrutura Cryo-EM dos domínios RBD-SD1 no ponto (figura 3E), com a densidade da reconstrução mostrada no verde para o domínio RBD-SD1, e cinza de outra maneira. O primeiro resíduo com densidade (R319) é destacado com uma esfera azul; dure pediu o resíduo do domínio RBD-SD1 (S591) é destacado com uma esfera vermelha. (h) Ideia do close-up dos términos do ponto RBD-SD1. (i) Seqüência da ponta de prova do domínio RBD-SD1 destacada no verde.
Definição Estrutura-Baseada das pontas de prova SARS-CoV-2 moleculars que compreendem a estrutura do Cryo-EM NTD, RBD e RBDSD1 dos domínios (a) do domínio de NTD na ponta de prova de S2P determinada neste estudo (figura 3E), com a densidade da reconstrução mostrada na laranja para o domínio de NTD, e o cinza de outra maneira. O primeiro pediu o resíduo com densidade (A27) é destacado com uma esfera azul; o último resíduo do domínio de NTD (S305) é destacado com uma esfera vermelha. (b) Ideia do close-up dos términos de NTD. (c) Seqüência da ponta de prova do domínio de NTD. A seqüência é destacada na laranja à exceção dos resíduos 14-26, que são desorganizado nas estruturas cryo-EM. (d) Estrutura Cryo-EM do domínio de RBD no ponto (figura 3E), com a densidade da reconstrução mostrada em ciano para o domínio de RBD, e cinza de outra maneira. O primeiro resíduo com densidade (L329) é destacado com uma esfera azul; dure pediu o resíduo do domínio de RBD (G526) é destacado com uma esfera vermelha. (e) Ideia do close-up dos términos do ponto RBD. (f) Seqüência da ponta de prova do domínio de RBD destacada em ciano. (g) Estrutura Cryo-EM dos domínios RBD-SD1 no ponto (figura 3E), com a densidade da reconstrução mostrada no verde para o domínio RBD-SD1, e cinza de outra maneira. O primeiro resíduo com densidade (R319) é destacado com uma esfera azul; dure pediu o resíduo do domínio RBD-SD1 (S591) é destacado com uma esfera vermelha. (h) Ideia do close-up dos términos do ponto RBD-SD1. (i) Seqüência da ponta de prova do domínio RBD-SD1 destacada no verde.

Para a revelação aerodinâmica de pontas de prova moleculars

Completamente, este tipo de projecto estrutura-baseado (acoplado aos processos eficientes da purificação e do biotinylation) pode permitir revelação aerodinâmica de pontas de prova do ponto-ectodomain SARS-CoV-2. Como demonstrado neste estudo, suas propriedades sugeriram que tais pontas de prova são realmente uma boa indicação biológica do ectodomain do ponto do prefusion SARS-CoV-2.

“Os métodos que estrutura-baseados nós descrevemos aqui para a construção da ponta de prova podem permitir a avaliação de respostas imunes do outro tipo - 1 fusão faz à máquina”, diz autores do estudo. Igualmente adicionam que as pontas de prova truncadas do domínio se dobraram correctamente e se preservaram a conformação nativa.

“Total, o projecto estrutura-baseado cortado e colado descrito aqui deve facilmente ser adaptado à revelação aerodinâmica de pontas de prova moleculars contra não somente estes micróbios patogénicos, mas os micróbios patogénicos igualmente emergentes, como mostrado aqui para SARS-CoV-2”, concluem autores do estudo.

O projecto da ponta de prova pode ser considerado um campo emergente que demonstre seu significado em etapas mais adicionais de informação para a medicina personalizada. Porque COVID-19 mostra a variação individual substancial na apresentação clínica, a aproximação particularizada é cada vez mais importante.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
  • Zhou, T. et al. (2020). Structure-Based Design with Tag-Based Purification and In-Process Biotinylation Enable Streamlined Development of SARS-CoV-2 Spike Molecular Probes. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2020.06.22.166033.
Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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