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El diseño estructurado del “cortar y pegar” habilita el revelado aerodinámico de las antenas moleculares SARS-CoV-2

Un estudio seminal de los investigadores de los E.E.U.U., actualmente disponibles en el servidor de la prueba preliminar del bioRxiv*, demuestra cómo el diseño estructura-basado se puede emplear eficientemente para desarrollar las antenas moleculares que apuntan el pico del coronavirus 2 de la neumonía asiática (SARS-CoV-2) y sus dominios, con uso futuro posible en diagnósticos, el tratamiento y el revelado vaccíneo.

La aparición de un coronavirus nuevo SARS-CoV-2 en China ha girado rápidamente en un pandémico global de la enfermedad del coronavirus (COVID-19). En el momento que, no hay vacunas aprobadas o terapéutica apuntada para el tratamiento de esta enfermedad, mientras que las pruebas diagnósticas todavía se están esforzando lograr sensibilidad y especificidad óptimas.

Por otra parte, los estudios estructurales fundamentales del virus están progresando en un paso sin precedente. Es ya bien sabido que la glicoproteína del pico SARS-CoV-2 (S-proteína) asciende el asiento de la célula y es el objetivo principal de la reacción serológica, especialmente su dominio receptor-obligatorio (RBD); también, el virus utiliza angiotensina-convertir la enzima 2 (ACE2) como receptor de la célula.

Micrográfo de electrón nuevo de la exploración de Coronavirus SARS-CoV-2 Colorized de una célula apoptotic (verde) infectada pesado con las partículas del virus SARS-COV-2 (púrpuras), aisladas de una muestra paciente. La imagen capturada en el NIAID integró el centro de investigación en el fuerte Detrick, Maryland. Haber: NIAID
Micrográfo de electrón nuevo de la exploración de Coronavirus SARS-CoV-2 Colorized de una célula apoptotic (verde) infectada pesado con las partículas del virus SARS-COV-2 (púrpuras), aisladas de una muestra paciente. Imagen capturada en el centro de investigación integrado de NIAID (IRF) en el fuerte Detrick, Maryland. Haber: NIAID

La promesa de antenas moleculares

Las antenas moleculares con la afinidad para los objetivos dominantes de ciertos virus pueden estar de utilidad amplia. Pueden servir como etiquetas moleculares facilitar la identificación de los anticuerpos efectivos para la terapia pasiva; además, pueden ser utilizadas para fijar reactividad de los sueros y para obtener marcadores sensibles de la infección, pero también para definir y para vigilar las reacciones sacadas necesarias para el revelado vaccíneo.

Como consecuencia, biotina-etiqueta las antenas moleculares que comprenden las regiones específicas de la S-proteína SARS-CoV-2 (es decir, un objetivo viral principal para el anticuerpo de la neutralización) puede de hecho ser muy útil en el aislamiento y la caracterización de los anticuerpos que apuntan este patógeno nuevamente emergido.

Un grupo de investigación del instituto nacional de los E.E.U.U. de la alergia y las enfermedades infecciosas, Universidad de Columbia, laboratorio nacional de Frederick para la investigación de cáncer, y la universidad de Kansas describió el diseño estructura-basado de antenas moleculares, del pico de abarcamiento SARS-CoV-2 y de sus dominios.

Estrategia para la purificación Etiqueta-Basar con el diseño esquemático de Biotinylation de la En-Olumna (a) de la construcción de la expresión de las antenas moleculares SARS-CoV-2. Un dominio constante de Ig del único ser humano de cadena (scFc) fue agregado en el término de N para facilitar la expresión y la purificación. La etiqueta de AVI fue colocada en el término de C después de una máquina para hacer chorizos ácida amino 10 para el biotinylation. Las flechas rojas en los segundos y cuartos dominios de Fc mostraron las mutaciones del “perilla-en-orificio” para prevenir la dimerización del scFc. (b) Digestión de Biotinylation y de HRV3C. El sobrenadante del cultivo celular de las células transfected transitorio con el plásmido fue cargado sobre olumna de afinidad de la proteína A. Las reacciones de hendidura de Biotinylation y de HRV3C se pueden realizar en serie o simultáneamente, pues los almacenadores intermedios para ambas reacciones son compatibles.
Estrategia para la purificación Etiqueta-Basar con el diseño esquemático de Biotinylation de la En-Olumna (a) de la construcción de la expresión de las antenas moleculares SARS-CoV-2. Un dominio constante de Ig del único ser humano de cadena (scFc) fue agregado en el término de N para facilitar la expresión y la purificación. La etiqueta de AVI fue colocada en el término de C después de una máquina para hacer chorizos ácida amino 10 para el biotinylation. Las flechas rojas en los segundos y cuartos dominios de Fc mostraron las mutaciones del “perilla-en-orificio” para prevenir la dimerización del scFc. (b) Digestión de Biotinylation y de HRV3C. El sobrenadante del cultivo celular de las células transfected transitorio con el plásmido fue cargado sobre olumna de afinidad de la proteína A. Las reacciones de hendidura de Biotinylation y de HRV3C se pueden realizar en serie o simultáneamente, pues los almacenadores intermedios para ambas reacciones son compatibles.

Trímero estabilizado del pico SARS-CoV-2 con el biotinylation

Para la construcción de la antena, los investigadores utilizaron un proceso que incorporó el montaje del “cortar y pegar” de componentes obligatorios, empleando una etiqueta de la purificación de la N-terminal y los alargamientos de la serie apuntados por las enzimas serie-específicas.

Más concretamente, los investigadores primero diseñaron una construcción que permitió el biotinylation etiqueta-basado de la purificación y de la en-olumna (este último que es un proceso covalente de sujetar la biotina a una proteína). Después, incorporaron el ectodomain del pico SARS-CoV-2 con las mutaciones y A.C. que se estabilizaban - adorno terminal del prefusion del trimerization.

Todas las antenas fueron caracterizadas para la antigenicidad y el reconocimiento de receptor ACE2, y la estructura de la antena del ectodomain del pico fue determinada además por microscopia del cryo-electrón. las especificidades y las capacidades Anticuerpo-obligatorias de la célula-clasificación de las antenas biotinylated también fueron caracterizadas detalladamente.

“También utilizamos la estructura del dominio obligatorio del receptor recombinante con ACE2 para definir las mutaciones que podrían inhibir la acción recíproca ACE2, que incorporamos en las antenas del mutante RBD con ACE2-recognition separadas por ablación”, autores del estudio explicamos más lejos su aproximación.

Finalmente, han caracterizado las propiedades adicionales de las antenas ideadas - incluyendo el grado de biotinylation y de uso potencial en la clasificación de las células de levadura que expresaban los anticuerpos SARS-CoV-2 o las B-células pico-obligatorios de los donantes convalecientes COVID-19.

Definición Estructura-Basada de las antenas moleculares SARS-CoV-2 que comprenden la estructura del Cryo-EM NTD, RBD y RBDSD1 de los dominios (a) del dominio de NTD en la antena de S2P determinada en este estudio (figura 3E), con la densidad de la reconstrucción mostrada en la naranja para el dominio de NTD, y el gris de otra manera. El primer pidió residuo con la densidad (A27) se destaca con una esfera azul; el residuo pasado del dominio de NTD (S305) se destaca con una esfera roja. (b) Opinión del primer de los términos de NTD. (c) Serie de la antena del dominio de NTD. La serie se destaca en naranja a excepción de los residuos 14-26, que son desordenados en las estructuras cryo-EM. (d) Estructura Cryo-EM del dominio de RBD en el pico (figura 3E), con la densidad de la reconstrucción mostrada en color cianita para el dominio de RBD, y gris de otra manera. El primer residuo con la densidad (L329) se destaca con una esfera azul; dure pidió el residuo del dominio de RBD (G526) se destaca con una esfera roja. (e) Opinión del primer de los términos del pico RBD. (f) Serie de la antena del dominio de RBD destacada en color cianita. Estructura del Cryo-EM del (G) de los dominios RBD-SD1 en el pico (figura 3E), con la densidad de la reconstrucción mostrada en el verde para el dominio RBD-SD1, y gris de otra manera. El primer residuo con la densidad (R319) se destaca con una esfera azul; dure pidió el residuo del dominio RBD-SD1 (S591) se destaca con una esfera roja. (h) Opinión del primer de los términos del pico RBD-SD1. (i) Serie de la antena del dominio RBD-SD1 destacada en verde.
Definición Estructura-Basada de las antenas moleculares SARS-CoV-2 que comprenden la estructura del Cryo-EM NTD, RBD y RBDSD1 de los dominios (a) del dominio de NTD en la antena de S2P determinada en este estudio (figura 3E), con la densidad de la reconstrucción mostrada en la naranja para el dominio de NTD, y el gris de otra manera. El primer pidió residuo con la densidad (A27) se destaca con una esfera azul; el residuo pasado del dominio de NTD (S305) se destaca con una esfera roja. (b) Opinión del primer de los términos de NTD. (c) Serie de la antena del dominio de NTD. La serie se destaca en naranja a excepción de los residuos 14-26, que son desordenados en las estructuras cryo-EM. (d) Estructura Cryo-EM del dominio de RBD en el pico (figura 3E), con la densidad de la reconstrucción mostrada en color cianita para el dominio de RBD, y gris de otra manera. El primer residuo con la densidad (L329) se destaca con una esfera azul; dure pidió el residuo del dominio de RBD (G526) se destaca con una esfera roja. (e) Opinión del primer de los términos del pico RBD. (f) Serie de la antena del dominio de RBD destacada en color cianita. Estructura del Cryo-EM del (G) de los dominios RBD-SD1 en el pico (figura 3E), con la densidad de la reconstrucción mostrada en el verde para el dominio RBD-SD1, y gris de otra manera. El primer residuo con la densidad (R319) se destaca con una esfera azul; dure pidió el residuo del dominio RBD-SD1 (S591) se destaca con una esfera roja. (h) Opinión del primer de los términos del pico RBD-SD1. (i) Serie de la antena del dominio RBD-SD1 destacada en verde.

Hacia el revelado aerodinámico de antenas moleculares

En conjunto, este tipo de diseño estructura-basado (acoplado a los procesos eficientes de la purificación y del biotinylation) puede habilitar el revelado aerodinámico de las antenas del pico-ectodomain SARS-CoV-2. Como se demuestra en este estudio, sus propiedades hicieron alusión que tales antenas son real un buen imitador biológico del ectodomain del pico del prefusion SARS-CoV-2.

“Los métodos estructura-basados que describimos aquí para la construcción de la antena pueden permitir la evaluación de inmunorespuestas de otras máquinas de la fusión del tipo 1”, dicen a autores del estudio. También agregan que las antenas truncadas del dominio doblaron correctamente y preservaron la conformación nativa.

“Total, el diseño estructura-basado cortar y pegar descrito aquí se debe adaptar fácilmente al revelado aerodinámico de antenas moleculares contra no sólo estos patógeno, pero los patógeno también emergentes, como se muestra aquí para SARS-CoV-2”, concluyen a autores del estudio.

El diseño de la antena se puede considerar un campo emergente que ha demostrado su significación en pasos posteriores de información hacia remedio personalizado. Pues COVID-19 muestra la variación individual sustancial en la presentación clínica, la aproximación individualizada es cada vez más importante.

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
  • Zhou, T. et al. (2020). Structure-Based Design with Tag-Based Purification and In-Process Biotinylation Enable Streamlined Development of SARS-CoV-2 Spike Molecular Probes. bioRxiv. https://doi.org/10.1101/2020.06.22.166033.
Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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