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O ensaio novo testa ràpida a neutralização SARS-CoV-2 e selecciona antivirais

Os pesquisadores no ramo médico da Universidade do Texas, Galveston, desenvolveram uma plataforma nova que pudesse ràpida testar a actividade de neutralização do anticorpo contra o coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) e executar a selecção da alto-produção de agentes antivirosos potenciais.

SARS-CoV-2, diagrama 2019 do vírus do nCoV. Crédito de imagem: Orpheus FX/Shutterstock
SARS-CoV-2, diagrama 2019 do vírus do nCoV. Crédito de imagem: Orpheus FX/Shutterstock

O ensaio novo, chamado o nanoluciferase SARS-CoV-2 (SARS-CoV-2-Nluc), gera resultados de neutralização do anticorpo mais rapidamente do que a técnica actual da bandeira de ouro, encurtando o tempo de resposta de três dias a cinco horas.

Igualmente executou a selecção antivirosa segura, da alto-produção e identificou o rupintrivir humano da droga do rhinovirus, como um inibidor potencial eficaz de SARS-CoV-2.

Os autores dizem que o rupintrivir pode agora ser considerado para que um teste mais adicional determine seu potencial como um tratamento para a doença 2019 do coronavirus (COVID-19).

Uma versão da pré-impressão do papel está disponível no server do bioRxiv*, quando o artigo se submeter à revisão paritária.

Técnicas de teste actuais

Desde que a pandemia COVID-19 começou em Wuhan, China, tarde no ano passado, RT-PCR baseado nucleico (reacção em cadeia reversa da transcriptase-polimerase) o teste foi usado para diagnosticar povos com infecção viral aguda e para seguir e controlar a transmissão do contacto.

Contudo, dado o número de indivíduos contaminados que são assintomáticos, o serodiagnosis rápido, e seguro é urgente necessário ajudar a estabelecer a escala verdadeira da infecção dentro das comunidades.

Além disso, poder avaliar o nível de anticorpos de neutralização rapidamente ajudaria pesquisadores a compreender a cargo-infecção da imunidade, a identificar doadores potenciais de anticorpos protectores, e a avaliar as vacinas que estão actualmente no encanamento.

Diversos ensaios serological foram desenvolvidos, mas a bandeira de ouro é até agora o teste de neutralização da redução da chapa (PRNT), desde que determina directamente os níveis de anticorpos de neutralização necessários inibir o selvagem-tipo vírus.

Contudo, a técnica é baixo-produção, com um tempo de resposta que faça inoportuno para o diagnóstico em grande escala de COVID-19.

O ensaio novo é alto-produção

“Uma plataforma da alto-produção facilitaria extremamente o teste COVID-19 serological e selecção antivirosa,” diga os pesquisadores.

Agora, Pei-Yong Shi e os colegas desenvolveram a plataforma de SARS-CoV-2-Nluc, um ensaio do vírus do repórter que exibisse a réplica similar ao selvagem-tipo SARS-CoV-2 in vitro.

Ao usar o ensaio para medir a neutralização do anticorpo nos soros dos pacientes com COVID-19, os resultados gerados eram comparáveis àqueles de PRNT convencional.

Além disso, o tempo de resposta conseguido com o ensaio da alto-produção SARS-CoV-2-Nluc (3 horas) era significativamente mais curto do que é conseguido actualmente com a baixo-produção PRNT (três dias).

Embora o ensaio seja executado em um formato de 96 poços para este estudo, Shi e os colegas dizem o valor e o alcance dinâmico do meio que do sinal de Nluc poderia facilmente ser adaptado ao 384 - ou um formato de 1536 poços para o teste em grande escala.

“Assim, o ensaio pode prontamente ser distribuído para a avaliação vacinal em grande escala e o teste de neutralização do anticorpo nos seres humanos,” escreve os pesquisadores.

Aplicação de SARS-CoV-2-Nluc em analisar hACE2 como um receptor da entrada. (a) Cinética da réplica de SARS-CoV-2-Nluc (IC Nluc) em pilhas de Vero E6. As pilhas foram contaminadas com IC Nluc em MOI 1,0. Em pontos dados do tempo, as pilhas foram colhidas para a medida do sinal do luciferase. Os meios e os desvios padrão de três experiências independentes são apresentados. (b) Diagram para analisar hACE2 para a entrada do IC Nluc. (c) O luciferase relativo sinaliza seguinte infecção das pilhas que preincubated com os anticorpos anti-hDPP4 ou anti-hACE2. Os sinais do luciferase dos grupos anticorpo-tratados foram normalizados àqueles dos grupos não tratados. O desvio médio e padrão de três experiências independentes é apresentado. (d) Análise da imunofluorescência da expressão hACE2 nas pilhas A549-hACE2. Em 24 h quesemeiam, as pilhas eram fixas e manchadas com o anticorpo anti-hACE2 polyclonal. (e) Luciferase sinaliza de IC Nluc as pilhas A549 e A549-hACE2 de infected561. As pilhas foram contaminadas com MOIs indicado e os sinais do luciferase foram medidos em 24 cargo-infecções de h.
Aplicação de SARS-CoV-2-Nluc em analisar hACE2 como um receptor da entrada. (a) Cinética da réplica de SARS-CoV-2-Nluc (IC Nluc) em pilhas de Vero E6. As pilhas foram contaminadas com IC Nluc em MOI 1,0. Em pontos dados do tempo, as pilhas foram colhidas para a medida do sinal do luciferase. Os meios e os desvios padrão de três experiências independentes são apresentados. (b) Diagram para analisar hACE2 para a entrada do IC Nluc. (c) O luciferase relativo sinaliza seguinte infecção das pilhas que preincubated com os anticorpos anti-hDPP4 ou anti-hACE2. Os sinais do luciferase dos grupos anticorpo-tratados foram normalizados àqueles dos grupos não tratados. O desvio médio e padrão de três experiências independentes é apresentado. (d) Análise da imunofluorescência da expressão hACE2 nas pilhas A549-hACE2. Em 24 h quesemeiam, as pilhas eram fixas e manchadas com o anticorpo anti-hACE2 polyclonal. (e) Luciferase sinaliza de IC Nluc as pilhas A549 e A549-hACE2 de infected561. As pilhas foram contaminadas com MOIs indicado e os sinais do luciferase foram medidos em 24 cargo-infecções de h.

Desenvolvendo o ensaio para a selecção antivirosa

Em seguida, a equipe desenvolveu uma versão do ensaio da infecção de SARS-CoV-2-Nluc para a selecção da alto-produção dos antivirais e validou o método usando inibidores conhecidos de SARS-CoV-2, incluindo o remdesivir e o chloroquine.

Usaram então o ensaio para testar o vário antiviral aprovado e de investigação e as drogas anti-infecciosas, incluindo conhecidos para trabalhar contra o VIH, o vírus da hepatite C, e o rhinovirus humano.

De 40 compostos testados (incluindo o remdesivir e o chloroquine usados para a validação), o ensaio identificou o nelfinavir das drogas do VIH e o cobicistat e o rupintrivir humano da droga do rhinovirus como os inibidores os mais poderosos e os mais selectivos de SARS-CoV-2-Nluc.

“Baseado em suas potências antivirosas estabelecidas in vitro, é improvável que o nelfinavir ou o cobicistat exerceriam efeitos clínicos principais nos pacientes COVID-19 nas doses clìnica aprovadas da corrente,” disse Shi e equipe.

Rupintrivir pode eficazmente inibir SARS-CoV-2

Contudo, o rupintrivir é um inibidor covalent selectivo dos 3 virais quimotripsina-como a enzima do protease do cysteine (3CLpro) que regula a réplica do coronavirus, diz os pesquisadores.

Rupintrivir pode, conseqüentemente, para inibir SARS-CoV-2 obstruindo a actividade principal do protease do cysteine 3CLpro, sugerem.

“Os estudos seriam exigidos mais compreender melhor o modo dos rupintrivir da acção, eficácia nos modelos animais, 268 e os benefícios clínicos potenciais nos pacientes COVID-19,” escrevem Shi e colegas.

Um rapid, alto-produção, ferramenta segura

Os pesquisadores dizem que o ensaio de SARS-CoV-2-Nluc representa um rapid, uma alto-produção, uma ferramenta segura para o teste da neutralização e uma selecção antivirosa da droga.

“Desde que neutralizar o titer é um parâmetro chave para prever a imunidade, o ensaio rápido da neutralização de SARS-CoV-2-Nluc permitirá muitos aspectos da pesquisa COVID-19, incluindo a fiscalização epidemiológica, revelação vacinal, e descoberta antivirosa,” escrevem.

Entre os agentes do antiviral testados, o “rupintrivir foi identificado como in vitro um inibidor selectivo de SARS-CoV-2 que pôde ser considerado para que uns estudos mais adicionais estabeleçam inteiramente seu potencial para o tratamento de COVID-19,” conclui a equipe.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:

Shi PY, et al. A nanoluciferase SARS-CoV-2 for rapid neutralization testing and screening of anti-infective drugs for COVID-19. bioRxiv 2020. doi: https://doi.org/10.1101/2020.06.22.165712

Sally Robertson

Written by

Sally Robertson

Sally first developed an interest in medical communications when she took on the role of Journal Development Editor for BioMed Central (BMC), after having graduated with a degree in biomedical science from Greenwich University.

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