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I ricercatori stabilizzano il trimero chiuso della punta SARS-CoV-2

Proprio mentre COVID-19 continua a spargersi intorno al mondo, i ricercatori stanno mettendo a fuoco sullo sviluppo vaccino ed antivirale. L'obiettivo di molto di questo studio è la proteina della punta (s) del coronavirus 2 (SARS-CoV-2), una componente trimeric di sindrome respiratorio acuto severo della particella virale che è responsabile del collegamento al ricevitore ospite, l'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2). Ora, un nuovo studio dai ricercatori ai vaccini di Janssen & prevenzione BV ed università di Leida e pubblicato sul cryoEM di usi del bioRxiv* del " server " della pubblicazione preliminare per rivelare la struttura di questo trimero, per supportare sia sviluppo del vaccino che prova diagnostica basati su produzione dell'anticorpo.

La proteina della punta

La proteina di S è una grande glicoproteina composta di due sottounità, di fusione dell'associazione che della membrana del recettore cellulare ospite di mediazione sia del virus e della cellula ospite per permettere all'entrata ed all'infezione virali della cellula ospite. L'sottounità S1 ha due parti separate, un dominio del N-terminale (NTD) e un dominio dell'ricevitore-associazione (RBD).

illustrazione 3D del diagramma della struttura SARS-CoV-2. Credito di immagine: Orfeo FX/Shutterstock
illustrazione 3D del diagramma della struttura SARS-CoV-2. Credito di immagine: Orfeo FX/Shutterstock O vicino

All'interfaccia S1/S2, c'è una proteasi del tipo di furin che è richiesta per la fenditura della proteina, che può anche essere effettuata tramite l'atto di TMPRSS2, un sito altamente conservato appena prima il peptide di fusione S2. La proteina di pre-fusione S ha suo RBD alternatamente su e giù o nelle configurazioni aperte e chiuse.

Nel precedente, la sede del legame del ricevitore è esposta transitoriamente al recettore cellulare ospite, o a tutto l'anticorpo. A causa di questo cambiamento nelle conformazioni che caratterizza intrinsecamente la proteina, la proteina di S è, come altre proteine di fusione della classe I, una proteina naturalmente metastabile.

Caratterizzazione strutturale di S-chiuso. (A) Struttura Cryo-EM della classe di S-chiuso-Fd - un trimero chiuso del trimero più abbondante della proteina di S. I monomeri sono colorati in arancione-chiaro, il bianco ed il grey e la punta è indicato dal lato (comitato superiore) e dal punto di vista superiore (del pannello inferiore). (B) ciascuna delle quattro mutazioni uniche introdotte in S-chiuso-Fd indicato dettagliatamente. I domini di nuova struttura sono colorati secondo lo stesso codice colore come utilizzato nel fico S1. Il limite fra i monomeri è stato indicato ulteriormente con la linea tratteggiata arancio una volta applicabile. Due rotamers possibili di K986 sono indicati poichè uno o l
Caratterizzazione strutturale di S-chiuso. (A) Struttura Cryo-EM della classe di S-chiuso-Fd - un trimero chiuso del trimero più abbondante della proteina di S. I monomeri sono colorati in arancione-chiaro, il bianco ed il grey e la punta è indicato dal lato (comitato superiore) e dal punto di vista superiore (del pannello inferiore). (B) ciascuna delle quattro mutazioni uniche introdotte in S-chiuso-Fd indicato dettagliatamente. I domini di nuova struttura sono colorati secondo lo stesso codice colore come utilizzato nel fico S1. Il limite fra i monomeri è stato indicato ulteriormente con la linea tratteggiata arancio una volta applicabile. Due rotamers possibili di K986 sono indicati poichè uno o l'altro non potrebbe definitivo essere definito basato sulla densità.

Ottimizzazione della proteina di Prefusion S

Il modulo di prefusion della proteina di S contiene gli epitopi a cui gli anticorpi di neutralizzazione legano ed è, quindi, un obiettivo principale per lo sviluppo dell'immunogeno. Affinchè questo accada, è necessario da stabilizzare la proteina di prefusion, poichè le glicoproteine quindi più recombinanti sulle particelle virali sono espresse, stimolante una risposta immunitaria.

Un modo stabilizzare questa proteina è stabilizzando il ciclo della cerniera che si trova appena prima l'elica centrale. Nei SAR-CoV e nel MERS-CoV più iniziali, questo è stato compiuto subendo una mutazione due amminoacidi successivi alla prolina nell'sottounità S2 nella regione che si trova fra l'elica centrale e la ripetizione 1. (HR) del heptad.

Ciò è stata rinviata nella proteina di SARS-CoV-2 S pure (SARS-CoV-2 S-2P). D'altra parte, questa proteina mutata di S è instabile. Lo studio corrente descrive i modi migliorare la sua stabilità.

Un altro aspetto da considerare è quello anticorpi di neutralizzazione ha il più alta potenza quando legano agli epitopi di RBD nel chiuso o nel downstate. Ciò significa che la proteina di prefusion deve essere stabilizzata in questa conformazione per ottenere un più forte immunogeno.

Stabilizzazione della proteina di S nella conformazione chiusa

L'instabilità della proteina di S non migliora così interamente neppure con l'introduzione di doppia prolina nel ciclo della cerniera. Lo studio corrente, in base aa progettazione basata a struttura, ha identificato le mutazioni di stabilizzazione del romanzo nei domini S1 e S2.

I ricercatori dimostrano quello con l'espressione migliorata del trimero dalle diverse mutazioni della prolina, le diminuzioni di variante di K986P l'interazione con la testa S1. Ciò induce il RBD ad essere in upstate, come valutato tramite l'associazione aumentata con sia il ACE2 che l'anticorpo CR3022. Quando la seconda mutazione di stabilizzazione, vale a dire, V987P, esiste, questo effetto è compensato parzialmente.

I ricercatori mostrano gli effetti di due gruppi supplementari di sostituzioni. Il primo è nella regione di ripetizione 1 (HR) del heptad S2, che è influenzata radicalmente da fusione. Nel secondo, la prolina e la glicina partecipano a parecchie mutazioni del ciclo per stabilizzare il trimero, aumentante il rendimento. Queste mutazioni S2 probabilmente aiutano con folding proteico richiesta per il cambiamento conformazionale quella fusione di grilletti. Quindi, l'espressione della proteina di prefusion S aumenta.

Poi puntano quattro mutazioni uniche (D614N, A892P, A942P e V987P) quella causa la proteina di S per rimanere in una conformazione stabile chiusa, ma con un'espressione più alta 6,4 volte, la stabilità al calore ed ai cicli di gelata-disgelo ed i beni antigenici simili a quello di un trimero chiuso.

Combinazione delle mutazioni per efficacia ottimale

Quando alcune di queste mutazioni si sono combinate, i ricercatori hanno ottenuto un trimero S-chiuso molto stabile con il più alta espressione della glicoproteina. Hanno incluso sia D614N che A892P, di cui tutt'e due hanno stabilizzato la proteina di S e A942P, che ha aumentato il rendimento della proteina.

Combinando questi con le proline nel ciclo della cerniera ha dato un mutante quadruplo (D614N+A892P+A942P+V987P) e un mutante quintuplo (tutto questi più K986P). Entrambi hanno prodotto un aumento quintuplo nei rendimenti, riguardante la variante di S-2P, ma gli ultimi avevano aumentato l'associazione ACE2. Quando il dominio eterologo di trimerization è stato cancellato, la proteina continuata per essere stabile ed infatti, il rendimento della proteina è salito 6,4 volte riguardante la variante di S-2P, anche se le strutture delle proteine solubili di S trovano questo dominio del foldon per essere essenziali.

Perché proteina chiusa della punta dell'obiettivo?

L'importanza di ottimizzazione della proteina della punta con la conformazione chiusa di RBD è che questa è come il virus è nella fase della trasmissione. Quindi, gli anticorpi che mirano al virus in questo stato sono probabili essere più protettivi contro l'infezione. Secondariamente, in questo stato, la superficie è conservata e quindi gli anticorpi inter-più reattivi possono essere indotti.

I ricercatori riassumono: “Un trimero chiuso stabile di S con le mutazioni non esposte minime e senza un foldon che mostra un importante crescita nei livelli di espressione può avanzare lo sviluppo (sottounità) degli immunogeno vaccino novelli e più ulteriormente migliorare i vaccini genetici, i sistemi diagnostici o l'isolamento degli anticorpi.„

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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