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Os pesquisadores estabilizam o trimer fechado do ponto SARS-CoV-2

Mesmo enquanto COVID-19 continua a espalhar em todo o mundo, os pesquisadores estão centrando-se sobre a revelação vacinal e antivirosa. O alvo de muito deste estudo é a proteína do ponto (s) do coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), um componente trimeric da partícula viral que é responsável para o acessório ao receptor do anfitrião, a enzima deconversão 2 (ACE2). Agora, um estudo novo por pesquisadores em vacinas de Janssen & prevenção BV e universidade de Leiden e publicado no cryoEM dos usos do bioRxiv* do server da pré-impressão para revelar a estrutura deste trimer, a fim apoiar a revelação vacinal e o teste diagnóstico baseados na produção do anticorpo.

A proteína do ponto

A proteína de S é uma grande glicoproteína compor de duas subunidades, de fusão do emperramento e da membrana do receptor da pilha de anfitrião da negociação do vírus e da pilha de anfitrião para permitir a entrada viral e a infecção da pilha de anfitrião. A subunidade S1 tem duas porções separadas, um domínio do N-terminal (NTD) e um domínio receptor-obrigatório (RBD).

ilustração 3D do diagrama da estrutura SARS-CoV-2. Crédito de imagem: Orpheus FX/Shutterstock
ilustração 3D do diagrama da estrutura SARS-CoV-2. Crédito de imagem: Orpheus FX/Shutterstock O perto

Na relação S1/S2, há a furin-como o protease que é exigido para a segmentação da proteína, que pode igualmente ser realizada pela acção de TMPRSS2, um local altamente conservado imediatamente antes do peptide da fusão S2. A proteína da pre-fusão S tem seu RBD alternadamente no para cima e para baixo ou em configurações abertas e fechados.

No anterior, o local obrigatório do receptor é expor transiente ao receptor da pilha de anfitrião, ou a todo o anticorpo. Devido a esta mudança nas conformações que caracteriza intrìnseca a proteína, a proteína de S é, como a outra classe mim proteínas da fusão, uma proteína naturalmente metastable.

Caracterização estrutural de S-fechado. (a) Estrutura Cryo-EM da classe a mais abundante de S-fechado-Fd - um trimer fechado do trimer da proteína de S. Os monómeros são coloridos na luz - alaranjada, branco e cinza e o ponto é mostrado do lado (painel superior) e (da opinião superior do mais baixo painel). (b) Cada um das quatro únicas mutações de ponto introduzidas no S-fechado-Fd mostrado em detalhe. Os domínios da estrutura nova são coloridos de acordo com o mesmo código de cor como usado no figo S1. O limite entre monómeros foi indicado adicionalmente com a linha tracejada alaranjada quando aplicável. Dois rotamers possíveis de K986 são mostrados porque um ou o outro não poderia definitiva ser atribuído baseado na densidade.
Caracterização estrutural de S-fechado. (a) Estrutura Cryo-EM da classe a mais abundante de S-fechado-Fd - um trimer fechado do trimer da proteína de S. Os monómeros são coloridos na luz - alaranjada, branco e cinza e o ponto é mostrado do lado (painel superior) e (da opinião superior do mais baixo painel). (b) Cada um das quatro únicas mutações de ponto introduzidas no S-fechado-Fd mostrado em detalhe. Os domínios da estrutura nova são coloridos de acordo com o mesmo código de cor como usado no figo S1. O limite entre monómeros foi indicado adicionalmente com a linha tracejada alaranjada quando aplicável. Dois rotamers possíveis de K986 são mostrados porque um ou o outro não poderia definitiva ser atribuído baseado na densidade.

Visando a proteína de Prefusion S

O formulário do prefusion da proteína de S contem os resumos a que os anticorpos de neutralização ligam, e são, conseqüentemente, um alvo principal para a revelação do imunogénio. Para que isto ocorra, é necessário estabilizar a proteína do prefusion, como umas glicoproteína desse modo mais de recombinação nas partículas virais são expressadas, estimulando uma resposta imune.

Uma maneira de estabilizar esta proteína é estabilizando o laço da dobradiça que se encontra imediatamente antes da hélice central. Nos SARS-CoV e no MERS-CoV mais adiantados, isto foi realizado transformando dois ácidos aminados sucessivos ao proline na subunidade S2 na região que encontra-se entre a hélice central e a repetição 1. (HR) do heptad.

Isto foi transferido na proteína de SARS-CoV-2 S também (SARS-CoV-2 S-2P). Por outro lado, esta proteína transformada de S é instável. O estudo actual descreve maneiras de aumentar sua estabilidade.

Um outro aspecto a ser considerado é aquele anticorpos de neutralização tem a potência a mais alta quando ligam aos resumos de RBD no fechado ou no downstate. Isto significa que a proteína do prefusion deve ser estabilizada nesta conformação para obter um imunogénio mais forte.

Estabilizando a proteína de S na conformação fechado

A instabilidade da proteína de S assim não melhora inteiramente mesmo com a introdução do proline dobro no laço da dobradiça. O estudo actual, com base no projecto estrutura-baseado, identificou mutações de estabilização da novela nos domínios S1 e S2.

Os pesquisadores demonstram aquele junto com a expressão aumentada do trimer pelas mutações individuais do proline, as diminuições da variação de K986P a interacção com a cabeça S1. Isto faz com que o RBD esteja no do norte do estado, como avaliado pelo emperramento aumentado com o ACE2 e o anticorpo CR3022. Quando a segunda mutação de estabilização, a saber, V987P, é no lugar, este efeito está compensado em parte.

Os pesquisadores mostram os efeitos de dois grupos adicionais de substituições. O primeiro está na região da repetição 1 (HR) do heptad S2, que é afectada radical pela fusão. No segundo, o proline e a glicina participam em diversas mutações do laço para estabilizar o trimer, aumentando o rendimento. Estas mutações S2 ajudam provavelmente com a dobradura de proteína exigida para a mudança conformational essa fusão dos disparadores. Assim, a expressão da proteína do prefusion S aumenta.

Dirigem então dentro em quatro mutações do único-ponto (D614N, A892P, A942P, e V987P) essa causa a proteína de S a permanecer em uma conformação estável fechado, mas com uma expressão 6,4 vezes mais alta, estabilidade ao calor e aos ciclos da gelo-aproximação amigável, e as propriedades antigénicas similares àquela de um trimer fechado.

Combinando mutações para a eficácia a melhor

Quando diversas destas mutações foram combinadas, os pesquisadores obtiveram um trimer S-fechado muito estável com expressão mais alta da glicoproteína. Incluíram D614N e A892P, ambo estabilizaram a proteína de S, e A942P, que aumentou o rendimento da proteína.

Combinar estes com os prolines no laço da dobradiça deu um mutante quádruplo (D614N+A892P+A942P+V987P), e um mutante do quintuple (todo o estes mais K986P). Ambos produziram um aumento quíntuplo nos rendimentos, relativo à variação de S-2P, mas os últimos tinham aumentado o emperramento ACE2. Quando o domínio heterologous do trimerization foi suprimido, a proteína continuada a ser estável, e de facto, o rendimento da proteína foi acima de 6,4 vezes relativo à variação de S-2P, mesmo que os projectos solúveis da proteína de S encontrassem este domínio do foldon para ser essenciais.

Por que proteína fechado do ponto do alvo?

A importância de visar a proteína do ponto com a conformação fechado de RBD é que esta é como o vírus é durante o processo de transmissão. Assim, os anticorpos que visam o vírus neste estado são prováveis ser mais protectores contra a infecção. Em segundo lugar, neste estado, a superfície é mais conservada, e conseqüentemente uns anticorpos cruz-mais reactivos podem ser induzidos.

Os pesquisadores resumem: “Um trimer fechado estável de S com mutações não-expostas mínimas e sem um foldon que mostre um aumento significativo em níveis da expressão pode avançar a revelação (subunidade) de imunogénio vacinais novos e mais melhorar vacinas genéticas, diagnósticos ou isolamento dos anticorpos.”

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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