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La représentation cryo-FIN DE SUPPORT avancée indique la structure à haute résolution du composé de réplication d'ARN viral

Pour la première fois, les scientifiques à l'institut de Morgridge pour la recherche se sont produits près des images atomiques de définition d'un composé important de protéine virale responsable de reproduire le génome d'ARN d'un membre des virus ARN de positif-boucle, la grande classe des virus qui comprend des coronaviruses et beaucoup d'autres agents pathogènes.

Les résultats devraient faciliter le développement des types neufs d'antivirals et fournir des analyses mécanistes dans la durée de vie utile de virus.

« La capacité rapidement de avancement de concevoir de telles structures essentielles est jeu changeant, » dit Paul Ahlquist, directeur de John W. et Jeanne M. Rowe Center pour la recherche en matière de virologie à l'institut de Morgridge et au professeur de l'oncologie et de la virologie moléculaire à l'université de Wisconsin-Madison. D'autres auteurs de l'étude avantage ont inclus de Nuruddin Unchwaniwala, de Hong Zhan, de Janice Pennington, de repère Horswill et de Johan repaire.

Utilisant une tomographie appelée du microscope de cryoelectron de technique avancée (cryo-FIN DE SUPPORT), Ahlquist et son équipe établis sur leurs anciens travaux, qui ont indiqué la première fois l'existence de ce composé tête tête de réplication d'ARN viral.

La recherche neuve, 20 juillet publié dans les démarches de l'académie nationale des sciences (PNAS), expositions le composé de tête de réplication à une définition spectaculairement améliorée d'approximativement 8,5 angströms, qui correspond à l'écartement de quelques atomes.

Cryo-FIN DE SUPPORT est récent passée par un bond prodigieux dans ses capacités. Dans cette étude nos avances multiples combinées par organisme de recherche pour améliorer grand la préparation des échantillons, l'acquisition des images et à traitement d'images, et pour tracer la position des domaines spécifiques de protéine dans le composé. »

Paul Ahlquist, directeur de John W. et Jeanne M. Rowe Center pour la recherche en matière de virologie à l'institut de Morgridge

Les virus ARN de positif-boucle adressés dans ce travail sont les plus grands de six classes génétiques des virus et comprennent beaucoup d'agents pathogènes importants tels que le Zika, virus de dengue et de chikungunya, ainsi que coronaviruses comme SARS-CoV-2, cause de la pandémie du courant COVID-19.

Dans chaque virus ARN de positif-boucle, la plupart des gènes viraux sont consacrées à un procédé unique : reproduire le génome d'ARN viral.

« Donné cet investissement massif des moyens, réplication de génome d'ARN viral est discutablement l'un des procédés les plus importants dans l'infection, et c'est déjà un objectif important pour le contrôle de virus, » Ahlquist dit.

Dans une cellule infectée, la réplication d'ARN viral se produit aux membranes cellulaires modifiées, souvent en association avec des spherules, les vésicules viro-induites approximativement 50-100 nanomètres dans la taille. Ahlquist et son équipe ont précédemment prouvé que dans chaque un tel composé de réplication de génome, une copie de l'ARN viral génome ou le chromosome est protégée à l'intérieur de la vésicule de spherule pour fonctionner comme matrice de réplication. Le composé de réplication copie à plusieurs reprises ce chromosome archivistique d'ARN viral pour produire les génomes neufs de progéniture qui sont déchargés par un col membraneux sur la vésicule dans le cytoplasme, où ils sont comportés comme charge utile des virions infectieux neufs.

Cet encore antérieur de travail prouvé que la protéine virale principale qui induit les vésicules de réplication et copie l'ARN viral demeure dans une structure saisissante de sonnerie ou de tête qui se repose placé sur le côté cytoplasmique du col de spherule qui branche au cytoplasme.

Les images cryo-FIN DE SUPPORT plus de haute résolution neuves et les résultats complémentaires prouvent que la tête se compose de douze copies de la protéine principale de réplication d'ARN viral disposée comme des barres dans un baril. Supplémentaire, les images ont indiqué les interactions comme une tirette qui agissent comme des cercles sur un baril de joindre les segments adjacents ensemble pour former la tête en forme d'anneau. Ces interactions zippering correspondent bien aux interactions multimerizing que le groupe d'Ahlquist a précédemment tracées en cette protéine.

La protéine de réplication d'ARN viral qui forme la tête est extrêmement une grande, multi-domaine, protéine multifonction, presque 1000 acides aminés dans la taille. Cette protéine contient la polymérase ARN et l'ARN recouvrant des domaines ; deux domaines enzymatiques qui sont économisés en travers de nombreux virus ARN de positif-boucle pour synthétiser le génome viral neuf copie ; plus d'autres domaines pour les membranes multimerizing et grippantes et d'autres fonctionnements.

Comment ces domaines sont matériel dispensés dans la structure de tête est l'un des la plupart des enjeux importants pour comprendre comment les fonctionnements complexes de réplication, et était l'une de plusieurs motivations intenses pour définir la structure à haute résolution de tête.

Utilisant une approche qui a combiné génétiquement conçu, la balise de site-détail avec le marquage par des particules d'or de nanoscale visible à cryo-FIN DE SUPPORT, les chercheurs a constaté que l'extrémité de polymérase de C-terminal de la protéine de réplication d'ARN viral est positionnée à l'apex de la tête, partant du domaine recouvrant de N-terminal au bas de la structure pour agir l'un sur l'autre avec la membrane.

Cette position apicale de la polymérase a des implications mécanistes importantes pour les premières étapes dans le procédé de réplication qui recrutent la matrice commençante d'ARN viral dans le composé et forment la vésicule de réplication, ainsi que pour des opérations postérieures dans lesquelles la matrice est copiée pour effectuer les génomes neufs de progéniture à empaqueter dans les particules infectieuses de virus. Ces résultats fournissent une base solide pour que d'autres expériences définissent la structure complexe et le fonctionnement de réplication encore à des niveaux plus élevés.

« Nous espérons continuer à améliorer la structure complexe de tête de réplication d'ARN pour fournir des améliorations importantes complémentaires à l'avenir, » Ahlquist dit. « Nous espérons également adresser des signes croissants de notre travail que les changements conformationnels de ces protéines sont critiques à leurs fonctionnements multiples. »

De « telles avances indiqueront dans le petit groupe croissant comment ces composés se réunissent et fonctionnent, et ainsi comment ils pourraient être meilleur attaqué, » il ajoute. « Ces analyses devraient constituer la base pour le roman, des mécanismes antiviraux plus intenses. »

Source:
Journal reference:

Unchwaniwala, N., et al. (2020) Subdomain cryo-EM structure of nodaviral replication protein A crown complex provides mechanistic insights into RNA genome replication. PNAS. doi.org/10.1073/pnas.2006165117.