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La rappresentazione avanzata cryo-EM rivela la struttura ad alta definizione del complesso virale della replica del RNA

Per la prima volta, gli scienziati all'istituto di Morgridge per la ricerca hanno generato vicino alle immagini atomiche di risoluzione di un complesso virale importante della proteina responsabile della replica del genoma del RNA di un membro dei virus a RNA del positivo-filo, la grande classe di virus che include i coronaviruses e molti altri agenti patogeni.

I risultati dovrebbero aiutare lo sviluppo dei nuovi tipi di antivirals e fornire le comprensioni meccanicistiche nel ciclo di vita del virus.

“La capacità rapido d'avanzamento di prevedere tali strutture cruciali è cacciagione che cambia,„ dice Paul Ahlquist, Direttore del John W. e Jeanne M. Rowe Center per ricerca nella virologia all'istituto di Morgridge ed al professore dell'oncologia e della virologia molecolare all'università di Wisconsin-Madison. Altri autori dello studio hanno incluso vantaggio della tana di Nuruddin Unchwaniwala, di Hong Zhan, di Janice Pennington, del segno Horswill e di Johan.

Facendo uso di una tecnica avanzata chiamata tomografia del microscopio del cryoelectron (cryo-EM), Ahlquist ed il suo gruppo costruiti sopra il loro lavoro precedente, che in primo luogo ha rivelato l'esistenza di questo complesso virale del tipo di corona della replica del RNA.

La nuova ricerca, pubblicata il 20 luglio negli atti dell'Accademia nazionale delle scienze (PNAS), mostra il complesso della corona della replica ad una risoluzione drammaticamente migliore di circa 8,5 angstrom, che corrisponde al gioco di alcuni atomi.

Il Cryo-EM recentemente ha passato con un salto quantico nelle sue capacità. In questo studio i nostri avanzamenti multipli combinati del gruppo di ricerca notevolmente per migliorare il preparato del campione, acquisizione di immagine e trattamento di immagine e per mappare la posizione dei domini specifici della proteina nel complesso.„

Paul Ahlquist, Direttore del John W. e Jeanne M. Rowe Center per ricerca in virologia all'istituto di Morgridge

I virus a RNA del positivo-filo arringati in questo lavoro sono il più grande di sei classi genetiche di virus ed includono molti agenti patogeni importanti quali lo Zika, la febbre rompiossa ed i virus Chikungunya come pure i coronaviruses come SARS-CoV-2, causa della pandemia corrente COVID-19.

In ogni virus a RNA del positivo-filo, la maggior parte dei geni virali sono votati ad un singolo trattamento: replica del genoma virale del RNA.

“Dato questo investimento massiccio delle risorse, la replica virale del genoma del RNA è discutibilmente uno dei trattamenti più importanti nell'infezione ed è già un obiettivo importante per controllo del virus,„ Ahlquist dice.

All'interno di una cella infettata, la replica virale del RNA si presenta alle membrane cellulari modificate, spesso in collaborazione con gli spherules, da vescicole indotte da virus circa 50-100 nanometri nella dimensione. Ahlquist ed il suo gruppo precedentemente hanno indicato che in ogni tale complesso della replica del genoma, una copia del genoma virale del RNA o il cromosoma è protetto dentro la vescicola dello spherule funzionare come modello della replica. Il complesso della replica copia ripetutamente questo cromosoma virale archivistico del RNA per produrre i nuovi genoma della progenie che sono scaricati attraverso un collo membranoso sulla vescicola nel citoplasma, in cui sono compresi come il carico utile di nuovi virions contagiosi.

Questo più ancora priore del lavoro indicato che la proteina virale chiave che induce le vescicole della replica e copia il RNA virale risiede in una struttura notevole della corona o dell'anello che si siede in cima al lato citoplasmico del collo dello spherule che connette con il citoplasma.

Le nuove immagini più di alta risoluzione cryo-EM ed i risultati complementari indicano che la corona è composta di dodici copie della proteina virale chiave della replica del RNA sistemata come sfonda un barilotto. Ulteriormente, le immagini hanno rivelato le interazioni del tipo di chiusura lampo che agiscono come i cerchi su un barilotto per unire insieme i segmenti adiacenti per formare la corona a forma di anello. Queste interazioni zippering corrispondono bene alle interazioni multimerizing che il gruppo di Ahlquist precedentemente ha mappato in questa proteina.

La proteina virale della replica del RNA che forma la corona è estremamente un grande, il multi-dominio, la proteina multifunzionale, quasi 1000 amminoacidi nella dimensione. Questa proteina contiene i settori di coperchiamento del RNA e del RNA polimerasi; due domini enzimatici che sono conservati attraverso i numerosi virus a RNA del positivo-filo per la sintetizzazione del genoma virale nuovo copia; più altri domini per le membrane multimerizing e leganti ed altre funzioni.

Come questi domini sono organizzati fisicamente nella struttura della corona sono una delle emissioni più importanti per la comprensione come le funzioni complesse della replica ed erano una di parecchie forti motivazioni per la definizione della struttura ad alta definizione della corona.

Facendo uso di un approccio che ha combinato un tag geneticamente costruito e sito-specifico con il contrassegno dalle particelle dell'oro del nanoscale visibile nel cryo-EM, i ricercatori ha trovato che l'estremità della polimerasi del C-terminale della proteina virale della replica del RNA è posizionata alla punta della corona, lasciante il dominio di coperchiamento del N-terminale al fondo della struttura per interagire con la membrana.

Questa posizione apicale della polimerasi ha implicazioni meccanicistiche importanti per i punti iniziali nel trattamento della replica che reclutano il modello virale cominciante del RNA nel complesso e formano la vescicola della replica come pure per i punti successivi in cui il modello è copiato per fare i nuovi genoma della progenie da imballare nelle particelle contagiose del virus. Questi risultati forniscono le forti fondamenta affinchè ulteriori esperimenti definiscano la struttura e la funzione complesse della replica ancora ai livelli elevati.

“Speriamo di continuare a migliorare la struttura complessa della corona della replica del RNA per fornire i perfezionamenti importanti supplementari in futuro,„ Ahlquist dice. “Egualmente speriamo di indirizzare le indicazioni crescenti dal nostro lavoro che i cambiamenti conformazionali in queste proteine siano critici alle loro funzioni multiple.„

“Tali avanzamenti riveleranno in dettaglio aumentante come questi complessi montano e funzionano e così come potrebbero essere il meglio attaccato,„ aggiunge. “Queste comprensioni dovrebbero fornire la base per il romanzo, più forti meccanismi antivirali.„

Source:
Journal reference:

Unchwaniwala, N., et al. (2020) Subdomain cryo-EM structure of nodaviral replication protein A crown complex provides mechanistic insights into RNA genome replication. PNAS. doi.org/10.1073/pnas.2006165117.