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A imagem lactente cryo-EM avançada revela a estrutura de alta resolução do complexo viral da réplica do RNA

Pela primeira vez, os cientistas no instituto de Morgridge para a pesquisa geraram perto das imagens atômicas da definição de um complexo viral principal da proteína responsável para replicating o genoma do RNA de um membro dos vírus do RNA da positivo-costa, a grande classe de vírus que inclui coronaviruses e muitos outros micróbios patogénicos.

Os resultados devem ajudar à revelação dos novos tipos de antivirais e fornecer introspecções mecanicistas no ciclo de vida do vírus.

“A capacidade ràpida de avanço para visualizar tais estruturas cruciais é jogo que muda,” diz Paul Ahlquist, director do John W. e Jeanne M. Rowe Centro para a pesquisa da virologia no instituto de Morgridge e no professor da oncologia e da virologia molecular na universidade de Wisconsin-Madison. Outros autores do estudo incluíram benefício do antro de Nuruddin Unchwaniwala, de Hong Zhan, de Janice Pennington, de Mark Horswill e de Johan.

Usando uma técnica avançada chamou o tomografia do microscópio do cryoelectron (cryo-EM), o Ahlquist e a sua equipe construídos em cima de seus trabalhos anteriores, que revelaram primeiramente a existência deste coroa-como o complexo viral da réplica do RNA.

A pesquisa nova, publicada o 20 de julho nas continuações da Academia Nacional das Ciências (PNAS), mostra o complexo da coroa da réplica em uma definição dramàtica melhorada de aproximadamente 8,5 ångströms, que corresponda ao afastamento de alguns átomos.

O Cryo-EM tem atravessado recentemente um salto quântico em suas capacidades. Neste estudo nossos avanços múltiplos combinados grupo de investigação para melhorar extremamente a preparação da amostra, a aquisição da imagem e o processamento de imagem, e para traçar a posição de domínios específicos da proteína no complexo.”

Paul Ahlquist, director do John W. e Jeanne M. Rowe Centro para a pesquisa da virologia no instituto de Morgridge

Os vírus do RNA da positivo-costa endereçados neste trabalho são os maiores de seis classes genéticas de vírus e incluem muitos micróbios patogénicos importantes tais como o Zika, vírus da dengue e do chikungunya, assim como coronaviruses como SARS-CoV-2, causa da pandemia COVID-19 actual.

Em cada vírus do RNA da positivo-costa, a maioria dos genes virais são devotados a um único processo: replicating o genoma viral do RNA.

“Dado este investimento maciço dos recursos, a réplica viral do genoma do RNA é discutìvel um dos processos os mais importantes na infecção, e é já um alvo principal para o controle do vírus,” Ahlquist diz.

Dentro de uma pilha contaminada, a réplica viral do RNA ocorre nas membranas celulares alteradas, frequentemente em colaboração com spherules, as vesículas vírus-induzidas aproximadamente 50-100 nanômetros em tamanho. Ahlquist e sua equipe mostraram previamente que em cada tal complexo da réplica do genoma, uma cópia do genoma viral do RNA ou o cromossoma estão protegidos dentro da vesícula do spherule para funcionar como um molde da réplica. O complexo da réplica copia repetidamente este cromossoma viral arquivístico do RNA para produzir os genomas novos da descendência que são liberados através de um pescoço membranoso na vesícula no citoplasma, onde são incorporados como a carga útil de virions infecciosos novos.

Este mais adicional prévio do trabalho mostrado que a proteína viral chave que induz as vesículas da réplica e copia o RNA viral reside em uma estrutura impressionante do anel ou da coroa que se sente sobre o lado citoplasmática do pescoço do spherule que conecta com o citoplasma.

As imagens cryo-EM mais de alta resolução novas e os resultados complementares mostram que a coroa está compor de doze cópias da proteína viral chave da réplica do RNA arranjada como pautas musicais em um tambor. Adicionalmente, as imagens reveladas zíper-como as interacções que actuam como aros em um tambor para se juntar junto a segmentos adjacentes para formar a coroa em forma de anel. Estas interacções zippering correspondem bem com as interacções multimerizing que o grupo de Ahlquist tem traçado previamente nesta proteína.

A proteína viral da réplica do RNA que forma a coroa é um extremamente grande, multi-domínio, proteína multi-funcional, quase 1000 ácidos aminados em tamanho. Esta proteína contem a polimerase de RNA e domínios tampando do RNA; dois domínios enzimáticos que são conservados através dos vírus numerosos do RNA da positivo-costa para sintetizar o genoma viral novo copiam; mais outros domínios para as membranas multimerizing, obrigatórias e as outras funções.

Como estes domínios são organizados fisicamente na estrutura da coroa são uma das edições as mais importantes para compreender como as funções complexas da réplica, e eram uma de diversas motivações fortes para definir a estrutura de alta resolução da coroa.

Usando uma aproximação que combinasse uma etiqueta genetically projetada, local-específica com rotulagem por partículas do ouro do nanoscale visível em cryo-EM, pesquisadores encontrou que a extremidade da polimerase do C-terminal da proteína viral da réplica do RNA está posicionada no vértice da coroa, saindo do domínio tampando do N-terminal na parte inferior da estrutura para interagir com a membrana.

Esta posição apical da polimerase tem implicações mecanicistas importantes para as etapas adiantadas no processo da réplica que recrutam o molde viral começando do RNA no complexo e formam a vesícula da réplica, assim como para umas etapas mais atrasadas em que o molde é copiado para fazer os genomas novos da descendência a ser empacotados em partículas infecciosas do vírus. Estes resultados fornecem uma fundação forte para que umas experiências mais adicionais definam a estrutura e a função complexas da réplica a mesmo níveis mais altos.

“Nós esperamos continuar a melhorar a estrutura complexa da coroa da réplica do RNA para fornecer refinamentos importantes adicionais no futuro,” Ahlquist diz. “Nós igualmente esperamos endereçar indicações crescentes de nosso trabalho que as mudanças conformational nestas proteínas são críticas a suas funções múltiplas.”

“Tais avanços revelarão no detalhe crescente como estes complexos montam e se operam, e assim como puderam ser melhor atacado,” adiciona. “Estas introspecções devem fornecer a base para a novela, uns mecanismos antivirosos mais fortes.”

Source:
Journal reference:

Unchwaniwala, N., et al. (2020) Subdomain cryo-EM structure of nodaviral replication protein A crown complex provides mechanistic insights into RNA genome replication. PNAS. doi.org/10.1073/pnas.2006165117.