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La proyección de imagen avanzada cryo-EM revela la estructura de alta resolución del complejo viral de la réplica del ARN

Por primera vez, los científicos en el instituto de Morgridge para la investigación han generado cerca de imágenes atómicas de la resolución de un complejo viral importante de la proteína responsable de replegar el genoma del ARN de una pieza de los virus del ARN del positivo-cabo, la clase grande de virus que incluye coronaviruses y muchos otros patógeno.

Los resultados deben ayudar al revelado de nuevos tipos de antivirals y ofrecer discernimientos mecánicos en el ciclo vital del virus.

“La capacidad rápidamente de avance de visualizar tales estructuras cruciales es juego que cambia,” dice a Paul Ahlquist, director del Juan W. y Jeanne M. Rowe Center para la investigación de la virología en el instituto de Morgridge y el profesor de la oncología y de la virología molecular en la universidad de Wisconsin-Madison. Otros autores del estudio incluyeron favor de la guarida de Nuruddin Unchwaniwala, de Hong Zhan, de Janice Pennington, de la marca Horswill y de Johan.

Usando una técnica avanzada llamada tomografía del microscopio del cryoelectron (cryo-EM), Ahlquist y sus personas construidos sobre su trabajo previo, que primero reveló la existencia de esto corona-como complejo viral de la réplica del ARN.

La nueva investigación, publicada el 20 de julio en los procedimientos de la National Academy of Sciences (PNAS), muestra el complejo de la corona de la réplica en una resolución dramáticamente perfeccionada de aproximadamente 8,5 angstromes, que corresponde a la separación de algunos átomos.

El Cryo-EM ha pasado recientemente con un salto cualitativo en sus capacidades. En este estudio nuestros avances múltiples combinados del grupo de investigación para perfeccionar grandemente la preparación de la muestra, la adquisición de la imagen y el tratamiento de la imagen, y para correlacionar la posición de los dominios específicos de la proteína en el complejo.”

Paul Ahlquist, director del Juan W. y Jeanne M. Rowe Center para la investigación de la virología en el instituto de Morgridge

Los virus del ARN del positivo-cabo dirigidos en este trabajo son los más grandes de seis clases genéticas de virus e incluyen muchos patógeno importantes tales como el Zika, los virus de la dengue y del chikungunya, así como los coronaviruses como SARS-CoV-2, causa del pandémico actual COVID-19.

En cada virus del ARN del positivo-cabo, la mayor parte de los genes virales se dedican a un único proceso: repliegue del genoma viral del ARN.

“Dado esta inversión masiva de recursos, la réplica viral del genoma del ARN es discutible uno de los procesos más importantes de la infección, y es ya un objetivo importante para el mando del virus,” Ahlquist dice.

Dentro de una célula infectada, la réplica viral del ARN ocurre en las membranas celulares modificadas, a menudo en asociación con glóbulos, las vesículas inducidas por virus aproximadamente 50-100 nanómetros de tamaño. Ahlquist y sus personas mostraron previamente que en cada tal complejo de la réplica del genoma, una copia del genoma viral del ARN o el cromosoma está protegida dentro de la vesícula del glóbulo para funcionar como un patrón de la réplica. El complejo de la réplica copia en varias ocasiones este cromosoma viral archival del ARN para producir los nuevos genomas de la progenie que se liberan a través de un cuello membranoso en la vesícula en el citoplasma, donde se incorporan como la carga útil de nuevos virions infecciosos.

Este más futuro anterior del trabajo mostrado que la proteína viral dominante que induce las vesículas de la réplica y copia el ARN viral reside en una estructura llamativa del anillo o de la corona que se siente encima del lado citoplásmico del cuello del glóbulo que conecta con el citoplasma.

Las nuevas imágenes más de alta resolución cryo-EM y los resultados complementarios muestran que la corona está compuesta de doce copias de la proteína viral dominante de la réplica del ARN dispuesta como bastones en un cañón de arma de fuego. Además, las imágenes reveladoras cremallera-como las acciones recíprocas que actúan como aros en un cañón de arma de fuego para ensamblar segmentos adyacentes juntos para formar anillo-como la corona. Estas acciones recíprocas zippering corresponden bien con las acciones recíprocas multimerizing que el grupo de Ahlquist ha correlacionado previamente en esta proteína.

La proteína viral de la réplica del ARN que forma la corona es una extremadamente grande, multi-dominio, proteína multifuncional, casi 1000 aminoácidos de tamaño. Esta proteína contiene la polimerasa de ARN y dominios que capsulan del ARN; dos dominios enzimáticos que se conservan a través de los virus numerosos del ARN del positivo-cabo para sintetizar el nuevo genoma viral copian; más otros dominios para las membranas multimerizing, obligatorias y otras funciones.

Cómo estos dominios se ordenan físicamente en la estructura de la corona es una de las entregas más importantes para entender cómo las funciones complejas de la réplica, y eran uno de varios estímulos fuertes para definir la estructura de alta resolución de la corona.

Usando una aproximación que combinó una etiqueta genético dirigida, sitio-específica con la etiqueta por las partículas del oro del nanoscale visible en cryo-EM, los investigadores encontró que el extremo de la polimerasa de la C-terminal de la proteína viral de la réplica del ARN está colocado en el ápice de la corona, saliendo del dominio que capsula de la N-terminal en la parte inferior de la estructura para obrar recíprocamente con la membrana.

Esta posición apical de la polimerasa tiene implicaciones mecánicas importantes para los pasos tempranos en el proceso de la réplica que reclutan el patrón viral del ARN que comienza en el complejo y forman la vesícula de la réplica, así como para pasos posteriores en los cuales el patrón se copie para hacer los nuevos genomas de la progenie que se empaquetarán en partículas infecciosas del virus. Estos resultados ofrecen un asiento fuerte para que otros experimentos definan la estructura y la función complejas de la réplica en incluso niveles más altos.

“Esperamos continuar perfeccionar la estructura compleja de la corona de la réplica del ARN para ofrecer refinamientos importantes adicionales en futuro,” Ahlquist dice. “También esperamos dirigir indicaciones cada vez mayor de nuestro trabajo que los cambios conformacionales en estas proteínas son críticos a sus funciones múltiples.”

“Tales avances revelarán en detalle cada vez mayor cómo estos complejos montan y operan, y así cómo puede ser que sean mejor atacado,” él agrega. “Estos discernimientos deben ofrecer la base para la novela, mecanismos antivirus más fuertes.”

Source:
Journal reference:

Unchwaniwala, N., et al. (2020) Subdomain cryo-EM structure of nodaviral replication protein A crown complex provides mechanistic insights into RNA genome replication. PNAS. doi.org/10.1073/pnas.2006165117.