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L'approche de ordonnancement neuve peut trouver la mutation rare dans le grand nombre des cellules

Une approche de ordonnancement peut autoguider dedans sur une mutation rare dans un grand nombre de cellules, indiquant des implications pour la retouche de génome de CRISPR et le dépistage du cancer tôt.

Le courant ordonnançant des techniques manquent de la sensibilité pour trouver des mutations géniques rares dans un groupe de cellules, qui est particulièrement important, par exemple, dans le dépistage du cancer tôt.

Maintenant, les scientifiques à KAUST ont développé une approche, la molécule d'ADN individuelle visée appelée ordonnançant (IDMseq), qui peut exactement trouver une mutation unique dans un groupe de 10.000 cellules.

D'une manière primordiale, l'équipe avait l'habitude avec succès IDMseq pour déterminer le nombre et la fréquence de mutations provoquées par l'outil de gène-retouche, CRISPR/Cas9, en cellules souche embryonnaires humaines. Les tests cliniques sont en cours pour vérifier la sécurité de CRISPR pour traiter quelques maladies génétiques.

Notre étude a indiqué des risques potentiels liés à la retouche CRISPR/Cas9 et fournit des outils pour améliorer des résultats de retouche de génome d'étude. »

MOIS Li, auteur important d'étude et Bioscientist, Université Polytechnique du Roi Abdullah

IDMseq est une technique de ordonnancement qui concerne fixer seul code barre à chaque molécule d'ADN dans un groupe des cellules et puis tirer un grand nombre de copies de chaque molécule utilisant une amplification en chaîne par polymérase (PCR). Les molécules copiées transportent même code barre que l'originel.

Une trousse à outils de bio-informatique, analyse variable appelée avec le seul identificateur moléculaire pour la technologie de long-Read (SAUT), traduit alors codes barre et les molécules assimilées de places selon leurs propres moyens des « coffres », avec chaque coffre représentant une des molécules d'ADN originelles. Le SAUT emploie une combinaison des algorithmes pour trouver des mutations dans les coffres.

Les travaux par processus spécialement bien avec le long-Read troisième génération ordonnançant des technologies et des scientifiques d'aides trouvent et déterminent la fréquence de tous les types de mutations, des changements des lettres uniques d'ADN à de grandes omissions et mises en place dans les molécules d'ADN originelles.

L'approche a avec succès trouvé une mutation génique délibérément entraînée qui a été mélangée à un groupe de cellules de type sauvage aux rapports de 1:100, de 1:1,000, et de 1:10,000. Il également correctement rapporté sa fréquence.

Les chercheurs avaient l'habitude également IDMseq pour rechercher des mutations provoquées par la retouche du génome CRISPR/Cas9.

« Plusieurs études récentes ont rapporté que Cas9 introduit des omissions inattendues et grandes d'ADN autour des gènes édités, menant aux préoccupations de sécurité. Il est difficile trouver et doser ces omissions utilisant le courant ADN ordonnançant des stratégies. Mais notre approche, en combination avec les plates-formes de ordonnancement variées, peut analyser ces grandes mutations d'ADN avec de grande précision et sensibilité, » dit le Bi de Chongwei de stagiaire de Ph.D.

Les tests ont constaté que les grandes omissions ont représenté 2.8-5.4 pour cent de résultats de la retouche Cas9. Ils ont également découvert une augmentation triple dans des variantes de l'unique-base ADN dans la région éditée.

« Ceci prouve qu'il y a beaucoup que nous devons nous renseigner sur CRISPR/Cas9 avant qu'il puisse être en toute sécurité employé dans la clinique, » dit Yanyi Huang de l'Université de Pékin, qui est un collaborateur international cofinancé par KAUST.

IDMseq peut actuel ordonnancer seulement un brin d'ADN, mais travaille pour activer l'ordonnancement de double-boucle pourrait davantage améliorer le rendement, disent les chercheurs.

Source:
Journal reference:

Bi, C., et al. (2020) Long-read individual-molecule sequencing reveals CRISPR-induced genetic heterogeneity in human ESCs. Genome Biology. doi.org/10.1186/s13059-020-02143-8.