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Il nuovo approccio d'ordinamento può individuare la mutazione rara in grande numero delle celle

Un approccio d'ordinamento può puntare una mutazione rara all'interno di tantissime celle, rivelanti le implicazioni per il genoma di CRISPR modificare e di rilevazione di cancro iniziale.

La corrente che ordina le tecniche manca della sensibilità per individuare le mutazioni genetiche rare in un gruppo di celle, che è particolarmente importante, per esempio, nella rilevazione di cancro iniziale.

Ora, gli scienziati a KAUST hanno sviluppato un approccio, chiamato molecola determinata mirata a del DNA che ordina (IDMseq), che può individuare esattamente una singola mutazione in un gruppo di 10.000 celle.

D'importanza, il gruppo ha utilizzato con successo IDMseq per determinare il numero e la frequenza delle mutazioni causate dallo strumento gene-modificante, CRISPR/Cas9, nelle cellule staminali embrionali umane. I test clinici sono in corso verificare la sicurezza di CRISPR per trattare alcune malattie genetiche.

Il nostro studio ha rivelato i rischi potenziali connessi con CRISPR/Cas9 che modifica e fornisce gli strumenti per migliorare il genoma di studio che modifica i risultati.„

Mo Li, autore principale di studio e Bioscientist, re Abdullah University di scienza e tecnologia

IDMseq è una tecnica d'ordinamento che comprende allegare un codice a barre unico ad ogni molecola del DNA in un campione delle celle e poi fare tantissime copie di ogni molecola facendo uso di una reazione a catena della polimerasi (PCR). Le molecole copiate portano lo stesso codice a barre di quei originali.

Un kit di utensili di bioinformatica, chiamato l'analisi variabile con l'identificatore molecolare unico per la tecnologia del a lungo read (VOLTA), poi decodifica i codici a barre e molecole dei posti le simili nei loro proprie “recipienti„, con ogni recipiente che rappresenta una delle molecole originali del DNA. La VOLTA usa una combinazione di algoritmi per individuare le mutazioni nei recipienti.

Gli impianti trattati specialmente bene con a lungo read di terza generazione che ordina le tecnologie e gli scienziati di guide individuano e determinano la frequenza di tutti i tipi di mutazioni, dai cambiamenti nelle singole lettere del DNA alle grandi eliminazioni ed inserzioni nelle molecole originali del DNA.

L'approccio ha individuato con successo una mutazione genetica deliberatamente causata che era mista con un gruppo di celle selvaggio tipe ai rapporti del 1:100, del 1:1,000 e del 1:10,000. Egualmente ha riferito correttamente la sua frequenza.

I ricercatori egualmente hanno usato IDMseq per cercare le mutazioni causate modificando del genoma CRISPR/Cas9.

“Parecchi studi recenti hanno riferito che Cas9 introduce le eliminazioni inattese e grandi del DNA intorno ai geni modificati, piombo alle preoccupazioni della sicurezza. Queste eliminazioni sono difficili da individuare e quantificare facendo uso di DNA corrente che ordina le strategie. Ma il nostro approccio, congiuntamente alle varie piattaforme d'ordinamento, può analizzare queste grandi mutazioni del DNA con alta precisione e sensibilità,„ dice la Bi di Chongwei dello studente di Ph.D.

Le prove hanno trovato che le grandi eliminazioni hanno rappresentato 2.8-5.4 per cento di Cas9 che modifica i risultati. Egualmente hanno scoperto un aumento triplo nelle varianti del DNA della unico base nella regione modificata.

“Questo indica che c'è molto che dobbiamo imparare circa CRISPR/Cas9 prima che possa essere utilizzato sicuro nella clinica,„ diciamo Yanyi Huang dell'università di Pechino, che è un collaboratore internazionale finanziato da KAUST.

IDMseq può corrente ordinare soltanto un filo del DNA, ma funziona per permettere all'ordinamento del doppio filo potrebbe più ulteriormente migliorare la prestazione, dice i ricercatori.

Source:
Journal reference:

Bi, C., et al. (2020) Long-read individual-molecule sequencing reveals CRISPR-induced genetic heterogeneity in human ESCs. Genome Biology. doi.org/10.1186/s13059-020-02143-8.