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Due obiettivi virali del gene hanno avuto bisogno di nella rilevazione SARS-CoV-2 dalla PCR, dicono i ricercatori

I ricercatori al Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco ed i collaboratori hanno messo in guardia contro soltanto l'ottimizzazione dell'un gene virale quando effettua la prova inversa di reazione a catena della transcriptase-polimerasi (RT-PCR) per il coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo.

Il gruppo ha condotto una rappresentazione di studio che una mutazione era sorto nel gene di N del virus che ha alterato la ricottura di una mano di fondo comunemente usata di RT-PCR.

Manu Vanaerschot e colleghi dice che l'organizzazione mondiale della sanità (WHO) raccomanda che in alcune aree dove la diffusione della comunità di SARS-CoV-2 è alta, la selezione di RT-PCR di appena un obiettivo discriminatorio sia considerata sufficiente.

Tuttavia, lo studio corrente ha identificato un cambiamento del nucleotide in una sequenza della mano di fondo del gene di N che ha interrotto la ricottura e l'amplificazione, quindi diminuente la sensibilità diagnostica.

I ricercatori dicono che i risultati supportano forte l'uso sistematico almeno di due obiettivi quando prova a SARS-CoV-2 facendo uso di RT-PCR, anche nelle aree dove i velociti di trasmissione sono alti.

Una versione della pubblicazione preliminare del documento è disponibile sul bioRxiv* del " server ", mentre l'articolo subisce la revisione tra pari.

Immagine al microscopio elettronico della trasmissione di un isolato dal primo caso degli Stati Uniti di COVID-19, precedentemente conosciuto come 2019-nCoV. Le particelle virali sferiche, blu colorized, contengono le sezioni trasversali attraverso il genoma virale, veduto come punti neri.
Immagine al microscopio elettronico della trasmissione di un isolato dal primo caso degli Stati Uniti di COVID-19, precedentemente conosciuto come 2019-nCoV. Le particelle virali sferiche, blu colorized, contengono le sezioni trasversali attraverso il genoma virale, veduto come punti neri. Credito di immagine: CDC Hannah Bullock; Azaibi Tamin

Le prove standard mirano generalmente a più di un gene virale

La prova sistematica per SARS-CoV-2 comprende facendo uso di RT-PCR provare a genoma virale in campioni respiratori e questa è effettuata solitamente facendo uso delle paia della mano di fondo che mirano a più di un gene virale.

Tuttavia, il WHO raccomanda quello “nelle aree dove il virus COVID-19 ampiamente è sparso, un algoritmo più semplice potrebbe essere adottato in cui, per esempio, schermare da RT-PCR di singolo obiettivo discriminatorio è considerata sufficiente.„

Delle autorizzazioni approvate dalla FDA di uso di emergenza che corrente esistono, soltanto lo schermo 36 per un obiettivo in RT-PCR analizza.

Il laboratorio diagnostico COVID-19 al Chan Zuckerberg Biohub e l'università di California San Francisco (CLIAHUB) sta ricevendo i campioni per la prova gratis dalle contee varie nella California dal 7 aprile 2020th.

Il protocollo comprende le analisi che mirano al gene di N ed al gene di E in SAR-VoV-2 ed altri gruppi usano comunemente queste analisi.

Che cosa lo studio ha compreso?

A luglio, i ricercatori hanno identificato un raggruppamento di 35 campioni dalla contea di Madera che ha mostrato la prestazione difficile di analisi per il gene di N, ma non dal gene di E ed il gruppo ora ha precisato per identificare le ragioni per le quali potenziali.

I ricercatori hanno valutato la concordanza dei valori di soglia (Ct) del ciclo per le due analisi in 3.957 prove di SARS-CoV-2-positive che sono state effettuate fra il 27 maggio ed il 7 agosto. Il valore di Ct è una misura relativa della concentrazione di obiettivo durante la PCR.

Di 3.629 campioni che erano positivi per il gene di E ed il gene di N, la differenza nel valore di Ct fra il gene di E e di N (ΔCt [nord-est]) era 0,40.

Il gruppo ha definito due insiemi mutanti del campione di potenziale.

Il primo insieme (collochi A), che ha compreso 42 campioni si è raccolto dalla contea di Madera fra il 30 giugnoth e 4 agostoth, campioni inclusi che hanno avuti un valore di ΔCt (nord-est) di 2,96 o più ed i valori 30 o di meno di Ct del gene di E.

Il gruppo riferisce che in campione collochi A, il ΔCt (nord-est) era una media di 5,35, rappresentante un danno approssimativo di 41 volta dell'amplificazione del gene di N.

Il secondo insieme del campione (collochi B), che ha compreso 19 campioni raccolti dalla contea di Madera durante lo stesso periodo di tempo, campioni inclusi di cui ha avuto un valore di Ct del gene di E più di 30 e un ΔCt (nord-est) di più di 2,96 o un valore di Ct del gene di E di più di 30 e nessun valore di Ct del gene di N individuato.

L'ordinamento ha identificato una mutazione

Ordinamento del frammento individuato del gene di N in campioni dall'insieme A, identificato 34 campioni che hanno avuti una singola mutazione nella sede del legame di andata della mano di fondo nel gene di N, che corrisponde a G29140T nel genoma SARS-CoV-2.

Gli altri otto campioni hanno avuti un frammento selvaggio tipo del gene di N, indicante che il più alto ΔCt medio (nord-est) di 5,99 che è stato osservato in questi campioni era un artefatto.

Di 17 casuale-ha selezionato i campioni di controllo a partire dalla contea di Madera di cui ha avuto un valore di ΔCt (nord-est) meno di 2,96, nessuno ha contenuto la mutazione di G29140T.

L'ordinamento del frammento individuato del gene in campioni dall'insieme B ha identificato dodici campioni che hanno avuti la mutazione di G29140T.

D'importanza, RT-PCR che mira al gene di N non ha individuato SARS-COV-2 in cinque di dieci 10 campioni, dice il gruppo.  

“Fortunatamente, questi casi potrebbero ancora essere riconosciuti come infettato per mezzo dell'analisi del gene di E,„ scriva i ricercatori.

per valutare l'effetto che la mutazione di G29140T ha avuta sull'ottimizzazione di PCR del gene di N, i ricercatori hanno sintetizzato una mano di fondo di andata del nuovo gene di N che ha avuta complementarità completa alla sequenza mutata ed hanno confrontato la prestazione di questa mano di fondo alla mano di fondo originale fra 16 mutanti e 14 tipo selvaggio campioni.

Fra i campioni mutanti, il ΔCt (nord-est) è caduto da 5,44 con la mano di fondo originale a 0,19 con la mano di fondo mutata. Fra i campioni selvaggio tipi, il ΔCt (nord-est) è aumentato da 0,46 con la mano di fondo originale a 7,34 con la mano di fondo mutata.

“Questi dati convalidano che la mutazione di G29140T è causativa per i valori aberranti osservati di Ct del gene di N,„ dicono il gruppo.

Almeno due obiettivi dovrebbero essere usati

Vanaerschot ed i colleghi dicono che i risultati dimostrano che anche nelle aree dove la diffusione della comunità di SARS-CoV-2 è alta, le mutazioni possono sorgere che alterano il riconoscimento delle mani di fondo di RT-PCR e fanno diminuire la sensibilità diagnostica. Ciò potrebbe piombo alla sotto-diagnosi se i laboratori usassero soltanto un obiettivo per rilevazione SARS-CoV-2.

“I nostri risultati supportano forte l'uso sistematico almeno di due obiettivi per rilevazione SARS-CoV-2 da RT-PCR,„ conclude il gruppo.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
  • Vanaerschot M, et al. Identification of a polymorphism in the N gene of SARS-CoV-2 that adversely impacts detection by a widely-used RT-PCR assay. bioRxiv 2020. doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.25.265074
Sally Robertson

Written by

Sally Robertson

Sally first developed an interest in medical communications when she took on the role of Journal Development Editor for BioMed Central (BMC), after having graduated with a degree in biomedical science from Greenwich University.

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