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L'étude infirme Ebselen et d'autres inhibiteurs à large spectre de SARS-CoV-2 Mpro

La pandémie du courant COVID-19 est provoquée par un virus ARN monocatenaire enveloppé, le coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de syndrôme respiratoire aigu sévère. Elle vient du genre des betacoronaviruses qui comprend également les deux virus hautement pathogènes qui ont entraîné des épidémies plus tôt de la maladie respiratoire - Radars à ouverture synthétique-CoV et MERS-CoV - ainsi que de deux autres coronaviruses humains (CoV), HCoV-OC43, et du HCoV-HKU1.

Le courant SARS-CoV-2 a une séquence d'ARN, qui est ~80% assimilé à celui de Radars à ouverture synthétique-CoV, et plusieurs des antivirals qui semblent être en activité contre lui ont été développés ainsi la première fois contre ce dernier ou tout autre CoV. Une telle catégorie de médicament est les inhibiteurs de la protéase principaux.

L'importance de Mpro

SARS-CoV-2 présente la cellule hôte en engageant dans le récepteur de l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2), exprimé sur les cellules hôte d'objectif. Après sa pièce d'assemblage au récepteur, il présente la cellule par l'intermédiaire de la fusion de membrane ou par intériorisation dans des endosomes. Dans le cytoplasme de cellule hôte, l'ARN viral est traduit en deux grands polyproteins. Ceux-ci sont fendus dans plusieurs protéines nonstructural, y compris les deux protéases virales, la protéase principale (Mpro), aussi 3 appelés la protéase comme une chymotrypsine (3CLpro), et la protéase comme une papaïne (PLpro).

Avec d'autres enzymes essentielles aimez le composé ARN-dépendant viral (RdRp) de polymérase ARN, ces protéases sont essentiels pour la réplication virale. N'importe quelle interférence avec n'importe quelle partie de la durée de vie utile virale, pour cette raison, arrêtera également la réplication virale. Ainsi, un des objectifs de médicament les plus importants dans le projecteur de la recherche contre SARS-CoV-2 est le Mpro.

Le Mpro est une protéase de cystéine qui produit 11 coupures ou plus dans le grand polyprotein viral. Il est également adapté à l'inhibition par les composés qui stockent les protéases de cellule hôte à cause de la seule préférence pour une glutamine P1 sur le substrat. Cette préférence est partagée par beaucoup d'autres enzymes virales de MPro, y compris le rhinovirus, le norovirus, et l'entérovirus.

Inhibiteurs spécifiques de Mpro

Comme résultat, plusieurs inhibiteurs efficaces de cette enzyme ont été conçus, qui contiennent un remplacement glutamine-mimetic de la pyrrolidone 2 à P1. Ceux-ci comprennent les inhibiteurs humains de Mpro de rhinovirus Rupintrivir (AG7088) et AG7404, et GC376, Radars à ouverture synthétique-CoV inhibants antiviraux à large spectre et MERS-CoV in vitro. In vivo les études dans les chats infectés avec le virus infectieux félin de péritonite ont confirmé son activité antivirale.

Inhibiteurs nouveaux

D'autres composés nouveaux avec l'activité inhibitrice de Mpro ont été également prétendus avoir l'activité antivirale. Ceux-ci comprennent ebselen, disulfirame, tideglusib, carmofur, shikonin, et PX-12. Un rapport de recherche neuf par les scientifiques à l'Université d'Arizona et au ressortissant et l'université de Kapodistrian d'Athènes et publié sur le bioRxiv* de serveur de prétirage discute le rôle de ces molécules en tant qu'inhibiteurs potentiels de Mpro dans la prévention de l'infection SARS-CoV-2.

Ebselen a été noté pour avoir l'activité anti-inflammatoire et antioxydante. Les deux ebselen et ses analogues ont l'anti-Mpro et anti-PLpro activité. Cependant, elle est rapportée pour avoir l'activité non spécifique contre beaucoup de protéines indépendantes aussi bien.

Le disulfirame a également l'activité inhibitrice grande contre plusieurs enzymes comme la méthyltransférase, l'urease, et la kinase par l'intermédiaire de leurs résidus de cystéine. Il a été rapporté pour empêcher Radars à ouverture synthétique-CoV et MERS-CoV PLpro aux concentrations micromolar. Toujours, cet effet est facilement annulé par le β-mercaptoéthanol, un agent réducteur qui est ajouté à une analyse enzymatique typique.

Carmofur empêche le ceramidase acide humain par l'intermédiaire de la modification covalente, alors que PX-12 empêche la polymérisation de tubulin. Tideglusib est un inhibiteur irréversible du glycogène synthase kinase-3β (GSK-3β).

Déterminer l'activité inhibitrice et antivirale

Parmi les six composés, ebselen la réplication SARS-CoV-2 seul inhibée à la concentration micromolar, tandis que disulfirame réduit il par un tiers. Les chercheurs ont-ils visé à trouver si ces composés peuvent particulièrement empêcher Mpro, ou l'inactivent-ils juste par n'importe lequel de plusieurs mécanismes non spécifiques ? Si oui, leur activité antivirale dans la cellule hôte reflète-t-elle le pouvoir de l'inhibition d'enzymes en termes de leur concentration inhibitrice (IC50) ?

Les chercheurs ont vérifié, pour cette raison, les six composés pour l'activité inhibitrice contre une Commission des protéases virales de cystéine, à savoir, le SARS-CoV-2 Mpro et PLpro, la protéase 2A (2Apro), et la protéase 3C (3Cpro) d'EV-A71 et d'EV-D68with et sans ajout de l'agent réducteur DTT. De ces derniers, EV-A71 3Cpro et EV-D68 3Cpro ont les propriétés se pliantes assimilées comme Mpro, avec les autres qui sont différents.

Ils ont employé des analyses multiples, y compris l'analyse enzymatique, l'analyse obligatoire de commande des vitesses thermique, et l'analyse indigène de spectroscopie (MS) de masse.

Analyse obligatoire de commande des vitesses thermique des protéases SARS-CoV-2, EV-A71, et EV-D68 contre des inhibiteurs vérifiés dans cette étude. (a) SARS-CoV-2 Mpro ; (b) SARS-CoV-2 PLPro ; (c) EV-A71 2Apro ; (d) EV-A71 3Cpro ; (e) EV-D68 2Apro ; et (f) EV-D68 3Cpro. la protéase de 3 µM dans son tampon correspondant de réaction enzymatique en présence de 4 millimètres DTT ou faute de DTT a été príncubée avec DMSO ou 40 inhibiteurs de la protéase de µM (le shikonin a été vérifié au µM 10 parce que 40 le µM Shikonin trempe complet le signe orange de fluorescence de teinture de SYPRO) au °C 30 pendant 30 mn. La température de fonte a été prévue car le mi log de la phase de passage de l
Analyse obligatoire de commande des vitesses thermique des protéases SARS-CoV-2, EV-A71, et EV-D68 contre des inhibiteurs vérifiés dans cette étude. (a) SARS-CoV-2 Mpro ; (b) SARS-CoV-2 PLPro ; (c) EV-A71 2Apro ; (d) EV-A71 3Cpro ; (e) EV-D68 2Apro ; et (f) EV-D68 3Cpro. la protéase de 3 µM dans son tampon correspondant de réaction enzymatique en présence de 4 millimètres DTT ou faute de DTT a été príncubée avec DMSO ou 40 inhibiteurs de la protéase de µM (le shikonin a été vérifié au µM 10 parce que 40 le µM Shikonin trempe complet le signe orange de fluorescence de teinture de SYPRO) au °C 30 pendant 30 mn. La température de fonte (Tm) a été prévue car le mi log de la phase de passage de l'indigène à la protéine dénaturée utilisant un Boltzmann model.32 * indique qu'on n'a pas observé une crête de fluorescence dans la courbe de fusion ; la ligne rouge de tableau de bord montre la protéase TM avec DMSO en présence de 4 millimètres DTT.

Inhibition non spécifique

Ils ont constaté qu'en présence de DTT, aucun de eux ne pouvait empêcher Mpro. Cependant, sans DTT, chacun des six a eu l'activité inhibitrice grande contre toutes les protéases virales, particulièrement contre le 2Apro et le 3Cpro d'EV-A71 et d'EV-D68. Ceci indique le cas de l'inhibition non spécifique dû à l'alkylation ou à l'oxydation du résidu de cystéine.

L'ajout d'un agent réducteur évite de tels effets, qui sont attendus pour être inchangés dans le cas d'un inhibiteur de la protéase spécifique de cystéine.

Deuxièmement, ils ont observé par des simulations de dynamique (MD) moléculaire que ces composés grippent à SARS-CoV-2 Mpro à l'affinité inférieure, supportant leur mécanisme non spécifique d'inhibition. Seulement le carmofur a probablement l'activité spécifique contre Mpro, mais le pouvoir inférieur.

Ainsi, ils résument : « Nous fournissons la proposition de preuves irréfutables qui ebselen, disulfirame, tideglusib, carmofur, shikonin, et PX-12 sont les inhibiteurs non spécifiques de SARSCoV-2 Mpro. »

Activité antivirale pas cellulaire

De nouveau, ces composés n'ont pas supprimé la réplication de l'un ou l'autre de ces virus à la concentration la plus élevée qui était compatible avec la sécurité. En d'autres termes, ils ont conclu, « le pouvoir enzymatique d'inhibition des inhibiteurs de la protéase de cystéine obtenus faute de DTT ne peuvent pas être employés pour prévoir l'activité antivirale cellulaire. »

En dépit du besoin urgent des antivirals efficaces de contenir la pandémie actuelle, les scientifiques doivent toujours observer la rigueur pour recenser les composés antiviraux spécifiques plutôt que des coups plus grands. Ainsi, tous les composés de promesse devraient être vérifiés tôt au cours du développement par des analyses secondaires pour éliminer l'activité non spécifique.  

Avis *Important

le bioRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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