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Lo studio invalida Ebselen ed altri inibitori di vasto-spettro SARS-CoV-2 Mpro

La pandemia corrente COVID-19 è causata da un virus a RNA unico incagliato avvolto, il coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo. Viene dal genere dei betacoronaviruses che egualmente include i due virus altamente patogeni che hanno causato le epidemie più iniziali della malattia respiratoria - SAR-CoV e MERS-CoV - come pure altri di due coronaviruses umani (CoV), HCoV-OC43 e di HCoV-HKU1.

Il SARS-CoV-2 corrente ha una sequenza del RNA, che è ~80% simile a quello di SAR-CoV e molti dei antivirals che sembrano essere attivi contro di in primo luogo sono stati sviluppati così contro gli ultimi o l'altro CoV. Una tale categoria della droga è gli inibitori di proteasi principali.

L'importanza di Mpro

SARS-CoV-2 registra la cellula ospite impegnandosi con il ricevitore dell'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2), espresso sulle cellule ospiti dell'obiettivo. A seguito del suo collegamento al ricevitore, registra la cella via fusione della membrana o tramite interiorizzazione all'interno dei endosomes. All'interno del citoplasma della cellula ospite, il RNA virale è tradotto in due grandi poliproteici. Questi sono fenduti in parecchie proteine nonstructural, compreso le due proteasi virali, la proteasi principale (Mpro), anche chiamate 3 proteasi del tipo di chimotripsina (3CLpro) e la proteasi del tipo di papaina (PLpro).

Con altri enzimi essenziali gradisca il complesso RNA-dipendente virale (RdRp) del RNA polimerasi, queste proteasi sono cruciale per la replicazione virale. Tutta l'interferenza con qualsiasi fase del ciclo virale di vita, quindi, egualmente fermerà la replicazione virale. Quindi, uno degli obiettivi della droga più importanti nel riflettore della ricerca contro SARS-CoV-2 è il Mpro.

Il Mpro è una proteasi della cisteina che produce 11 o più taglio nel grande poliproteico virale. Egualmente è adatto ad inibizione dai composti che risparmiano le proteasi della cellula ospite a causa della preferenza unica per una glutamina P1 sul substrato. Questa preferenza è divisa da molti altri enzimi virali di MPro, compreso il rhinovirus, il norovirus e l'enterovirus.

Inibitori specifici di Mpro

Di conseguenza, parecchi inibitori potenti di questo enzima sono stati progettati, che contengono una sostituzione glutamina-mimetica di pirrolidone 2 a P1. Questi includono gli inibitori umani Rupintrivir (AG7088) e AG7404 di Mpro del rhinovirus e GC376, uno vasto-spettro sia SAR-CoV d'inibizione antivirali che MERS-CoV in vitro. In vivo gli studi in caponi infettati con il virus contagioso felino della peritonite hanno confermato la sua attività antivirale.

Inibitori novelli

Altri composti novelli con attività inibitoria di Mpro egualmente sono stati reclamati per avere attività antivirale. Questi includono ebselen, disulfiram, tideglusib, carmofur, shikonin e PX-12. Una nuova pubblicazione dagli scienziati all'università dell'Arizona ed al cittadino e dall'università di Kapodistrian di Atene e pubblicata sul bioRxiv* del " server " della pubblicazione preliminare discute il ruolo di queste molecole come inibitori potenziali di Mpro nella prevenzione dell'infezione SARS-CoV-2.

Ebselen è stato notato per avere attività antinfiammatoria ed antiossidante. Entrambi ebselen ed i sui analoghi hanno attività anti--Mpro e anti--PLpro. Tuttavia, è riferito per avere attività non specifica contro molte proteine indipendenti pure.

Disulfiram egualmente ha vasta attività inibitoria contro parecchi enzimi come il methyltransferase, l'ureasi e la chinasi via i loro residui della cisteina. È stato riferito per inibire SAR-CoV e MERS-CoV PLpro alle concentrazioni micromolar. Eppure, questo effetto è annullato facilmente da β-mercaptoetanolo, un agente riduttore che si aggiunge ad un'analisi enzimatica tipica.

Carmofur inibisce il ceramidase acido umano via modifica covalente, mentre PX-12 inibisce la polimerizzazione della tubulina. Tideglusib è un inibitore irreversibile della sintasi kinase-3β (GSK-3β) del glicogeno.

Provando ad attività inibitoria ed antivirale

Fra i sei composti, ebselen la replica da solo inibita SARS-CoV-2 a concentrazione micromolar, mentre il disulfiram la ha diminuita da un terzo. I ricercatori hanno mirato a trovare se questi composti possono specificamente inibire Mpro, o appena lo inattivano da c'è ne di parecchi meccanismi non specifici? In caso affermativo, la loro attività antivirale nella cellula ospite rispecchia la potenza di inibizione d'enzimi in termini di loro concentrazione inibitoria (IC50)?

I ricercatori, quindi, hanno provato i sei composti ad attività inibitoria contro un comitato delle proteasi virali della cisteina, vale a dire, il SARS-CoV-2 Mpro e PLpro, 2A la proteasi (2Apro) e 3C la proteasi (3Cpro) da EV-A71 e da EV-D68with e senza l'aggiunta dell'agente riduttore DTT. Di questi, EV-A71 3Cpro e EV-D68 3Cpro hanno simili beni d'profilatura come Mpro, con gli altri che sono dissimili.

Hanno usato le analisi multiple, compreso l'analisi enzimatica, l'analisi obbligatoria dello spostamento termico e l'analisi indigena della spettroscopia (MS) di massa.

Analisi obbligatoria dello spostamento termico delle proteasi SARS-CoV-2, EV-A71 e EV-D68 contro gli inibitori esaminatori in questo studio. (A) SARS-CoV-2 Mpro; (B) SARS-CoV-2 PLPro; (C) EV-A71 2Apro; (D) EV-A71 3Cpro; (E) EV-D68 2Apro; e (F) EV-D68 3Cpro. una proteasi di 3 µM in suo buffer enzimatico corrispondente della reazione in presenza di 4 millimetri DTT o in assenza di DTT è stata preincubata con DMSO o 40 inibitori di proteasi del µM (shikonin è stato provato a µM 10 perché 40 il µM Shikonin completamente estigue il segnale arancio della fluorescenza della tintura di SYPRO) a °C 30 per 30 min. La temperatura di fusione è stata calcolata poichè il metà di registro della fase di transizione dal nativo alla proteina denaturata facendo uso di un Boltzmann model.32 * indica che un picco della fluorescenza non è stato osservato nella curva di fusione; la riga rossa del un poco mostra la proteasi TM con DMSO in presenza di 4 millimetri DTT.
Analisi obbligatoria dello spostamento termico delle proteasi SARS-CoV-2, EV-A71 e EV-D68 contro gli inibitori esaminatori in questo studio. (A) SARS-CoV-2 Mpro; (B) SARS-CoV-2 PLPro; (C) EV-A71 2Apro; (D) EV-A71 3Cpro; (E) EV-D68 2Apro; e (F) EV-D68 3Cpro. una proteasi di 3 µM in suo buffer enzimatico corrispondente della reazione in presenza di 4 millimetri DTT o in assenza di DTT è stata preincubata con DMSO o 40 inibitori di proteasi del µM (shikonin è stato provato a µM 10 perché 40 il µM Shikonin completamente estigue il segnale arancio della fluorescenza della tintura di SYPRO) a °C 30 per 30 min. La temperatura di fusione (Tm) è stata calcolata poichè il metà di registro della fase di transizione dal nativo alla proteina denaturata facendo uso di un Boltzmann model.32 * indica che un picco della fluorescenza non è stato osservato nella curva di fusione; la riga rossa del un poco mostra la proteasi TM con DMSO in presenza di 4 millimetri DTT.

Inibizione non specifica

Hanno trovato che in presenza di DTT, nessuno di loro potevano inibire Mpro. Tuttavia, senza DTT, tutto e sei le ha avuto vasta attività inibitoria contro tutte le proteasi virali, particolarmente contro il 2Apro e il 3Cpro da EV-A71 e da EV-D68. Ciò indica l'avvenimento di inibizione non specifica dovuto alchilazione o l'ossidazione del residuo della cisteina.

L'aggiunta di un agente riduttore impedisce tali effetti, che si pensano che siano invariati nel caso di un inibitore di proteasi specifico della cisteina.

Secondariamente, hanno osservato con le simulazioni di dinamica (MD) molecolare che questi composti legano a SARS-CoV-2 Mpro ad affinità bassa, supportante il loro meccanismo non specifico di inibizione. Soltanto il carmofur possibilmente ha l'attività specifica contro Mpro, ma potenza bassa.

Quindi, riassumono: “Forniamo il suggerimento che ebselen, il disulfiram, il tideglusib, il carmofur, shikonin di prova coercitiva e PX-12 sono inibitori non specifici di SARSCoV-2 Mpro.„

Attività antivirale non cellulare

Di nuovo, questi composti non sono riuscito a sopprimere la replica dell'uno o l'altro di questi virus all'più alta concentrazione che fosse coerente con la sicurezza. Cioè hanno concluso, “la potenza enzimatica di inibizione degli inibitori di proteasi della cisteina ottenuti in assenza di DTT non possono essere usati per predire l'attività antivirale cellulare.„

Malgrado il bisogno urgente per gli efficaci antivirals di contenere la pandemia in corso, gli scienziati ancora devono osservare il rigore per identificare i composti antivirali specifici piuttosto che i più vasti colpi. Quindi, tutti i composti di promessa dovrebbero essere provati presto nel corso dello sviluppo dalle analisi secondarie per eliminare l'attività non specifica.  

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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