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O estudo invalida Ebselen e outros inibidores do largo-espectro SARS-CoV-2 Mpro

A pandemia COVID-19 actual é causada por um vírus único-encalhado envolvido do RNA, coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2). Vem do género dos betacoronaviruses que igualmente inclui os dois vírus altamente patogénicos que causaram umas epidemias mais adiantadas da doença respiratória - SARS-CoV e MERS-CoV - assim como outros de dois coronaviruses humanos (CoV), HCoV-OC43, e de HCoV-HKU1.

O SARS-CoV-2 actual tem uma seqüência do RNA, que seja ~80% similar àquele dos SARS-CoV, e muitos dos antivirais que parecem ser activos contra ele foram desenvolvidos assim primeiramente contra os últimos ou o outro CoV. Uma tal categoria da droga é os inibidores de Protease principais.

A importância de Mpro

SARS-CoV-2 incorpora a pilha de anfitrião contratando com o receptor deconversão da enzima 2 (ACE2), expressado nas pilhas de anfitrião do alvo. Depois de seu acessório ao receptor, incorpora a pilha através da fusão da membrana ou pela internalização dentro dos endosomes. Dentro do citoplasma da pilha de anfitrião, o RNA viral é traduzido em dois grandes polyproteins. Estes são fendidos em diversas proteínas nonstructural, incluindo os dois proteases virais, o protease principal (Mpro), igualmente chamado 3 quimotripsina-como o protease (3CLpro), e papain-como o protease (PLpro).

Junto com outras enzimas essenciais goste do complexo RNA-dependente viral da polimerase (RdRp) de RNA, estes proteases são crucial para a réplica viral. Toda a interferência com qualquer parte do ciclo de vida viral, conseqüentemente, igualmente parará a réplica viral. Assim, um dos alvos os mais importantes da droga no projector da pesquisa contra SARS-CoV-2 é o Mpro.

O Mpro é um protease do cysteine que produza 11 ou mais cortes no grande polyprotein viral. É serido igualmente à inibição pelos compostos que poupam os proteases da pilha de anfitrião devido à preferência original para uma glutamina P1 na carcaça. Esta preferência é compartilhada por muitas outras enzimas virais de MPro, incluindo o rhinovirus, o norovirus, e o enterovírus.

Inibidores específicos de Mpro

Em conseqüência, diversos inibidores poderosos desta enzima foram projectados, que contêm uma substituição glutamina-mimetic do pyrrolidone 2 em P1. Estes incluem os inibidores humanos Rupintrivir (AG7088) e AG7404 de Mpro do rhinovirus, e GC376, um antiviral SARS-CoV de inibição e MERS-CoV do largo-espectro in vitro. In vivo os estudos nos gatos contaminados com o vírus infeccioso felino da peritonite confirmaram sua actividade antivirosa.

Inibidores novos

Outros compostos novos com actividade inibitório de Mpro foram reivindicados igualmente ter a actividade antivirosa. Estes incluem ebselen, disulfiram, tideglusib, carmofur, shikonin, e PX-12. Um artigo de investigação novo por cientistas na Universidade do Arizona e no nacional e por universidade de Kapodistrian de Atenas e publicada no bioRxiv* do server da pré-impressão discute o papel destas moléculas como inibidores potenciais de Mpro na prevenção da infecção SARS-CoV-2.

Ebselen foi notado para ter a actividade anti-inflamatório e antioxidante. Ambos ebselen e seus analogs têm a anti-Mpro e anti-PLpro actividade. Contudo, relata-se para ter a actividade não específica contra muitas proteínas não relacionadas também.

Disulfiram igualmente tem a actividade inibitório larga contra diversas enzimas como o methyltransferase, o urease, e a quinase através de seus resíduos do cysteine. Relatou-se para inibir SARS-CoV e MERS-CoV PLpro em concentrações micromolar. Ainda, este efeito é anulado facilmente pelo β-mercaptoethanol, um agente de diminuição que seja adicionado a um ensaio enzimático típico.

Carmofur inibe o ceramidase ácido humano através da alteração covalent, quando PX-12 inibir a polimerização do tubulin. Tideglusib é um inibidor irreversível da sintase kinase-3β do glycogen (GSK-3β).

Teste para a actividade inibitório e antivirosa

Entre os seis compostos, ebselen a réplica SARS-CoV-2 apenas inibida na concentração micromolar, quando o disulfiram a reduziu por um terço. Os pesquisadores apontaram encontrar se estes compostos podem especificamente inibir Mpro, ou apenas neutralizar-lo por alguns de diversos mecanismos não específicos? Em caso afirmativo, sua actividade antivirosa na pilha de anfitrião espelha a potência da inibição de enzimas em termos de sua concentração inibitório (IC50)?

Os pesquisadores, testaram conseqüentemente os seis compostos para a actividade inibitório contra um painel de proteases virais do cysteine, a saber, o SARS-CoV-2 Mpro e PLpro, o protease 2A (2Apro), e protease 3C (3Cpro) de EV-A71 e de EV-D68with e sem a adição do agente de diminuição DTT. Destes, EV-A71 3Cpro e EV-D68 3Cpro têm propriedades de dobramento similares como Mpro, com o outro que é dissimilar.

Usaram os ensaios múltiplos, incluindo o ensaio enzimático, ensaio obrigatório da SHIFT térmica, e o ensaio nativo da espectroscopia (MS) em massa.

Ensaio obrigatório da SHIFT térmica dos proteases SARS-CoV-2, EV-A71, e EV-D68 contra os inibidores investigados neste estudo. (a) SARS-CoV-2 Mpro; (b) SARS-CoV-2 PLPro; (c) EV-A71 2Apro; (d) EV-A71 3Cpro; (e) EV-D68 2Apro; e (f) EV-D68 3Cpro. o protease de 3 µM em seu amortecedor enzimático correspondente da reacção na presença de 4 milímetros DTT ou na ausência de DTT pre-foi incubado com DMSO ou 40 inibidores de protease do µM (o shikonin foi testado no µM 10 porque 40 o µM Shikonin extingue completamente o sinal alaranjado da fluorescência da tintura de SYPRO) no °C 30 por 30 Min. A temperatura de derretimento foi calculada porque o registro meados de da fase de transição do nativo à proteína desnaturada usando um Boltzmann model.32 * indica que um pico da fluorescência não estêve observado na curva de derretimento; a linha vermelha do traço mostra o protease TM com o DMSO na presença de 4 milímetros DTT.
Ensaio obrigatório da SHIFT térmica dos proteases SARS-CoV-2, EV-A71, e EV-D68 contra os inibidores investigados neste estudo. (a) SARS-CoV-2 Mpro; (b) SARS-CoV-2 PLPro; (c) EV-A71 2Apro; (d) EV-A71 3Cpro; (e) EV-D68 2Apro; e (f) EV-D68 3Cpro. o protease de 3 µM em seu amortecedor enzimático correspondente da reacção na presença de 4 milímetros DTT ou na ausência de DTT pre-foi incubado com DMSO ou 40 inibidores de protease do µM (o shikonin foi testado no µM 10 porque 40 o µM Shikonin extingue completamente o sinal alaranjado da fluorescência da tintura de SYPRO) no °C 30 por 30 Min. A temperatura de derretimento (Tm) foi calculada porque o registro meados de da fase de transição do nativo à proteína desnaturada usando um Boltzmann model.32 * indica que um pico da fluorescência não estêve observado na curva de derretimento; a linha vermelha do traço mostra o protease TM com o DMSO na presença de 4 milímetros DTT.

Inibição não específica

Encontraram que na presença de DTT, nenhuns dele podiam inibir Mpro. Contudo, sem DTT, todos os seis tiveram a actividade inibitório larga contra todos os proteases virais, especialmente contra o 2Apro e o 3Cpro de EV-A71 e de EV-D68. Isto indica a ocorrência da inibição não específica devido ao alkylation ou à oxidação do resíduo do cysteine.

A adição de um agente de diminuição impede tais efeitos, que são esperados ser inalterados no caso de um inibidor de protease específico do cysteine.

Em segundo lugar, observaram com as simulações da dinâmica (MD) molecular que estes compostos ligam a SARS-CoV-2 Mpro na baixa afinidade, apoiando seu mecanismo não específico da inibição. Somente o carmofur tem possivelmente a actividade específica contra Mpro, mas a baixa potência.

Assim, resumem: “Nós fornecemos a sugestão de obrigação que ebselen, disulfiram da evidência, tideglusib, carmofur, shikonin, e PX-12 são inibidores não específicos de SARSCoV-2 Mpro.”

Nenhuma actividade antivirosa celular

Além disso, estes compostos não suprimiram a réplica de qualquer um destes vírus na concentração a mais alta que era consistente com a segurança. Ou seja concluíram, “a potência enzimático da inibição dos inibidores de protease do cysteine obtidos na ausência de DTT não podem ser usados para prever a actividade antivirosa celular.”

Apesar da necessidade urgente para que os antivirais eficazes contenham a pandemia em curso, os cientistas ainda precisam de observar o rigor para identificar compostos antivirosos específicos um pouco do que umas batidas mais largas. Assim, todos os compostos de promessa devem ser testados cedo no curso da revelação por ensaios secundários para ordenar para fora a actividade não específica.  

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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