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El estudio invalida Ebselen y otros inhibidores del amplio-espectro SARS-CoV-2 Mpro

El pandémico actual COVID-19 es causado por un virus de una sola fila envuelto del ARN, coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática. Viene del género de betacoronaviruses que también incluye los dos virus altamente patógenos que causaron epidemias anteriores de la enfermedad respiratoria - los SARS-CoV y MERS-CoV - así como de dos otros coronaviruses humanos (CoV), HCoV-OC43, y de HCoV-HKU1.

El SARS-CoV-2 actual tiene una serie del ARN, que es el ~80% similar al de los SARS-CoV, y muchos de los antivirals que parecen ser activos contra él primero fueron desarrollados así contra los estes último o el otro CoV. Una tal categoría de la droga es los inhibidores de proteasa principales.

La importancia de Mpro

SARS-CoV-2 incorpora la célula huesped empeñando con el receptor de la enzima angiotensina-que convierte 2 (ACE2), expresado en las células huesped de objetivo. Después de su agregación al receptor, incorpora la célula vía la fusión de la membrana o por la internalización dentro de endosomes. Dentro del citoplasma de la célula huesped, el ARN viral se traduce a dos polyproteins grandes. Éstos se hienden en varias proteínas nonstructural, incluyendo las dos proteasas virales, la proteasa principal (Mpro), también llamada 3 quimotripsina-como la proteasa (3CLpro), y papaína-como la proteasa (PLpro).

Junto con otras enzimas esenciales tenga gusto del complejo ARN-relacionado viral de la polimerasa (RdRp) de ARN, estas proteasas son crucial para la réplica viral. Cualquier interferencia con cualquier parte del ciclo vital viral, por lo tanto, también parará la réplica viral. Así, uno de los objetivos más importantes de la droga del proyector orientable de la investigación contra SARS-CoV-2 es el Mpro.

El Mpro es una proteasa de la cisteína que produce 11 o más cortes en el polyprotein viral grande. También es adaptado a la inhibición por las composiciones que pasan sin las proteasas de la célula huesped debido a la preferencia única por una glutamina P1 en el substrato. Esta preferencia es compartida por muchas otras enzimas virales de MPro, incluyendo rinovirus, norovirus, y enterovirus.

Inhibidores específicos de Mpro

Como consecuencia, varios inhibidores potentes de esta enzima se han diseñado, que contienen una substitución glutamina-mimética de la pirrolidona 2 en P1. Éstos incluyen los inhibidores humanos Rupintrivir (AG7088) y AG7404 de Mpro del rinovirus, y GC376, un amplio-espectro SARS-CoV de inhibición antivirus y MERS-CoV in vitro. In vivo los estudios en los gatos infectados con el virus infeccioso felino de la peritonitis han confirmado su actividad antivirus.

Inhibidores nuevos

Otras composiciones nuevas con la actividad inhibitoria de Mpro también se han demandado para tener actividad antivirus. Éstos incluyen ebselen, disulfiram, tideglusib, carmofur, shikonin, y PX-12. Un nuevo trabajo de investigación por los científicos en la Universidad de Arizona y el nacional y la universidad de Kapodistrian de Atenas y publicada en el bioRxiv* del servidor de la prueba preliminar discute el papel de estas moléculas como inhibidores potenciales de Mpro en la prevención de la infección SARS-CoV-2.

Ebselen se ha observado para tener actividad antiinflamatoria y antioxidante. Ambos ebselen y sus análogos tienen actividad anti-Mpro y anti-PLpro. Sin embargo, se denuncia para tener actividad no específica contra muchas proteínas sin relación también.

Disulfiram también tiene actividad inhibitoria amplia contra varias enzimas como methyltransferase, ureasa, y cinasa vía sus residuos de la cisteína. Se ha denunciado para inhibir SARS-CoV y MERS-CoV PLpro en las concentraciones micromolar. No obstante, este efecto es anulado fácilmente por el β-mercaptoetanol, un reductor que se agregue a un análisis enzimático típico.

Carmofur inhibe el ceramidase ácido humano vía la modificación covalente, mientras que PX-12 inhibe la polimerización del tubulin. Tideglusib es un inhibidor irreversible del synthase kinase-3β (GSK-3β) del glicógeno.

Prueba para la actividad inhibitoria y antivirus

Entre las seis composiciones, ebselen la réplica solamente inhibida SARS-CoV-2 en la concentración micromolar, mientras que el disulfiram la redujo por un tercero. ¿Los investigadores apuntaron encontrar si estas composiciones pueden inhibir específicamente Mpro, o apenas lo desactivan por ningunos de varios mecanismos no específicos? (IC50)¿Si es así su actividad antivirus en la célula huesped refleja la potencia de la inhibición de enzimas en términos de su concentración inhibitoria?

Los investigadores, por lo tanto, probaron las seis composiciones para la actividad inhibitoria contra un panel de las proteasas virales de la cisteína, a saber, el SARS-CoV-2 Mpro y PLpro, la proteasa 2A (2Apro), y proteasa 3C (3Cpro) de EV-A71 y de EV-D68with y sin la adición del reductor DTT. De éstos, EV-A71 3Cpro y EV-D68 3Cpro tienen propiedades que doblan similares como Mpro, con los otros siendo disímiles.

Utilizaron análisis múltiples, incluyendo análisis enzimático, análisis obligatorio del movimiento térmico, y análisis nativo de la espectroscopia (MS) en masa.

Análisis obligatorio del movimiento térmico de las proteasas SARS-CoV-2, EV-A71, y EV-D68 contra los inhibidores investigados en este estudio. (a) SARS-CoV-2 Mpro; (b) SARS-CoV-2 PLPro; (c) EV-A71 2Apro; (d) EV-A71 3Cpro; (e) EV-D68 2Apro; y (f) EV-D68 3Cpro. la proteasa de 3 µM en su almacenador intermedio enzimático correspondiente de la reacción en presencia de 4 milímetros DTT o en ausencia de DTT fue preincubada con DMSO o 40 inhibidores de proteasa del µM (el shikonin fue probado en el µM 10 porque 40 el µM Shikonin apaga totalmente la señal anaranjada de la fluorescencia del tinte de SYPRO) en el °C 30 por 30 Min. La temperatura que fundía era calculada pues el mediados de tronco de la fase de transición del natural a la proteína desnaturalizada usando un Boltzmann model.32 * indica que un pico de la fluorescencia no fue observado en la curva que fundía; la línea roja de la rociada muestra la proteasa TM con DMSO en presencia de 4 milímetros DTT.
Análisis obligatorio del movimiento térmico de las proteasas SARS-CoV-2, EV-A71, y EV-D68 contra los inhibidores investigados en este estudio. (a) SARS-CoV-2 Mpro; (b) SARS-CoV-2 PLPro; (c) EV-A71 2Apro; (d) EV-A71 3Cpro; (e) EV-D68 2Apro; y (f) EV-D68 3Cpro. la proteasa de 3 µM en su almacenador intermedio enzimático correspondiente de la reacción en presencia de 4 milímetros DTT o en ausencia de DTT fue preincubada con DMSO o 40 inhibidores de proteasa del µM (el shikonin fue probado en el µM 10 porque 40 el µM Shikonin apaga totalmente la señal anaranjada de la fluorescencia del tinte de SYPRO) en el °C 30 por 30 Min. La temperatura que fundía (Tm) era calculada pues el mediados de tronco de la fase de transición del natural a la proteína desnaturalizada usando un Boltzmann model.32 * indica que un pico de la fluorescencia no fue observado en la curva que fundía; la línea roja de la rociada muestra la proteasa TM con DMSO en presencia de 4 milímetros DTT.

Inhibición no específica

Encontraron que en presencia de DTT, ninguno de él podía inhibir Mpro. Sin embargo, sin DTT, el seis tenían actividad inhibitoria amplia contra todas las proteasas virales, especialmente contra el 2Apro y el 3Cpro de EV-A71 y de EV-D68. Esto indica el acontecimiento de la inhibición no específica debido a la alcohilación o a la oxidación del residuo de la cisteína.

La adición de un reductor previene tales efectos, que se prevee que sean inalterados en el caso de un inhibidor de proteasa específico de la cisteína.

En segundo lugar, observaron con simulaciones de la dinámica (MD) molecular que estas composiciones atan a SARS-CoV-2 Mpro en la afinidad inferior, soportando su mecanismo no específico de la inhibición. Solamente el carmofur tiene posiblemente actividad específica contra Mpro, pero potencia inferior.

Así, resumen: “Ofrecemos sugerir que ebselen, disulfiram, tideglusib, carmofur, shikonin de las pruebas que obliga, y PX-12 son inhibidores no específicos de SARSCoV-2 Mpro.”

Actividad antivirus no celular

Una vez más estas composiciones no pudieron suprimir la réplica de cualquiera de estos virus en la concentración más alta que era constante con seguro. Es decir concluyeron, “la potencia enzimática de la inhibición de los inhibidores de proteasa de la cisteína obtenidos en ausencia de DTT no pueden ser utilizados para predecir la actividad antivirus celular.”

A pesar de la necesidad urgente de antivirals efectivos de contener el pandémico en curso, los científicos todavía necesitan observar rigor para determinar composiciones antivirus específicas bastante que golpes más amplios. Así, cualquier composición prometedora se debe probar temprano en el curso del revelado por análisis secundarios para eliminar la actividad no específica.  

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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