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Il metodo d'ordinamento novello ha potuto essere utile per la ricerca COVID-19

I ricercatori all'università di Chicago ed alla clinica di Cleveland hanno presentato un RNA unicellulare novello che ordina il metodo che potrebbe essere una domanda utile di ricerca sulla pandemia corrente di malattia 2019 di coronavirus (COVID-19).

La tecnica, chiamata FD-seguente, è un metodo di alto-capacità di lavorazione per all'l'ordinamento basato a gocciolina degli unicellulari compatibili con il trattamento del paraformaldeide (PFA).

Corrente, studi d'ordinamento unicellulari che richiedono la proteina che macchia o inattivazione dell'agente patogeno è limitato dal fatto che i metodi di alto-capacità di lavorazione non sono compatibili con il trattamento di PFA, una tecnica ampiamente usata per il tessuto/fissazione delle cellule.

La nuova tecnica FD-seguente presentata da Savaș Tay (l'università di Chicago) e colleghi è particolarmente utile per lo studio delle sottopopolazioni rare delle celle che richiedono la macchiatura intracellulare della proteina e l'Ordinare-arricchimento Fluorescenza-Attivato (FACS) nelle cellule.

Nello studio corrente, il gruppo usa FD-seguente per affrontare due problemi importanti in virologia.

In primo luogo, i ricercatori hanno studiato i fattori ospite che supportano la riattivazione del herpesvirus sarcoma-associato di Kaposi (KSHV) in celle del tumore.

Secondariamente, hanno usato FD-seguente per esplorare la risposta ospite in un modello in vitro dell'infezione di coronavirus OC43.

Questo coronavirus è un parente del coronavirus respiratorio acuto severo 2 (SARS-CoV-2), l'agente che causa COVID-19, quindi indicante l'uso potenziale di FD-seguente per ricerca sulla pandemia corrente.

Una versione della pubblicazione preliminare del documento è disponibile sul bioRxiv* del " server ", mentre l'articolo subisce la revisione tra pari.

Sfide affrontate in RNA unicellulare che ordina gli studi

Il RNA unicellulare che ordina (scRNA-seguente) ha vaste applicazioni importanti, dalla scoperta dei tipi nuovi delle cellule a mappare il transcriptome delle cellule staminali embrionali.

alle le tecnologie scRNA-seguenti basate a gocciolina sono incredibilmente potenti, a causa della loro alta capacità di lavorazione, che permette all'analisi di migliaia di unicellulari in un singolo esperimento.

Tuttavia, anche con la disponibilità di queste tecniche di alto-capacità di lavorazione, lo studio delle popolazioni rare delle cellule rimane provocatorio perché richiede spesso l'arricchimento a base di proteine della popolazione delle cellule.

Questo arricchimento può a volte essere raggiunto facendo uso degli indicatori della superficie delle cellule e di FACS. Eppure, alcuni tipi delle cellule richiedono la proteina intracellulare che macchia e questo significa spesso che la fissazione con PFA è necessaria aumentare il rapporto di segnale--sfondo.

Tuttavia, la fissazione di PFA presenta una sfida in RNA che ordina perché gli acidi nucleici chimicamente sono uniti con legami atomici incrociati alle proteine intracellulari.

“per recuperare RNA di alta qualità dalle singole celle PFA-fisse, un protocollo appropriato di inversione del legame incrociato che mantiene l'integrità del RNA e minimizza la perdita del RNA è cruciale,„ ha detto Tay ed i colleghi.

FD-seguente rivela le celle pro-infiammatorie dello spettatore dopo l
FD-seguente rivela le celle pro-infiammatorie dello spettatore dopo l'infezione di coronavirus OC43. tracciati del t-SNE (di a-b) con le celle colorate dall'identità del cluster (a) o (b) tipo del campione. (c) tracciato della barra che mostra la percentuale delle celle infettate (definite come celle che hanno espresso almeno la 1 trascrizione virale) di derisione infettata e campione del MOI 1. (d) il tracciato del violino che mostra la distribuzione della trascrizione virale totale conta. (e) tracciato del violino che mostra la distribuzione della percentuale della trascrizione virale totale dall'identità del cluster. (f) Heatmap che mostra il livello relativo di espressione di ogni gene virale di ogni unicellulare nel cluster 2. La linea blu mostra la percentuale di ogni cellule delle trascrizioni virali totali. (g) il violino traccia mostrare l'espressione di quattro geni in relazione con immune rappresentativi che upregulated nel cluster 0. (h) tracciato della barra che mostra i P-valori di regolato delle vie upregulated di KEGG nei cluster 1 e 2. La linea tratteggiata verticale indica il P-valore = 0,05.

Che cosa i ricercatori hanno fatto?

Ora, il gruppo ha indicato che FD-seguente è un metodo particolarmente utile di alto-capacità di lavorazione per all'l'ordinamento basato a gocciolina del RNA delle sottopopolazioni rare delle cellule che richiedono la fissazione di PFA.

Il gruppo ha usato il metodo per affrontare due problemi provocatori in virologia.

In primo luogo, hanno studiato i fattori ospite che influenzano la riattivazione sarcoma-associata del herpesvirus di Kaposi (KSHV) in celle del tumore.

I ricercatori dicono che c'è considerevole interesse nella comprensione dei dettagli molecolari dei fattori ospite che modulano la latenza e la riattivazione di KSHV perché questi sono conosciuti per contribuire al tumorigenesis virale. L'induzione terapeutica della riattivazione ha potuto sensibilizzare le celle latente-infettate alle droghe anti--herpesvirus attualmente disponibili.

Usando FD-seguente analizzare una popolazione rara delle celle che supportano la riattivazione di KSHV, il gruppo ha identificato quattro geni ospite - CDH1, CORO1C, ISCU e TMEM119 - di cui i livelli hanno correlato forte con la riattivazione virale.

Facendo uso della rappresentazione della in tensione-cella e di uno studio di del tempo corso su espressione genica virale, i ricercatori hanno trovato che del transmembrane) il gene TMEM119 (proteina 119 ha avuto l'effetto più pronunciato in termini di induzione della riattivazione di KSHV. Ulteriore analisi da RNA-seguente in serie indicato che questo effetto di TMEM119 potrebbe essere mediato con la via di segnalazione di MAPK.

Applicando la tecnica ad un parente di SARS-CoV-2

Dopo, i ricercatori hanno studiato la risposta immunitaria delle celle umane del polmone all'infezione con il coronavirus OC43, un parente di SARS-CoV-2 che causa il raffreddore.

“OC43 è stato usato con successo per scoprire le droghe che inibiscono la replica SARS-CoV-2 in vitro,„ dice il gruppo.

A seguito dell'esposizione al virus, la maggior parte delle celle non potevano supportare un ad alto livello di espressione genica virale e delle vie immuni pro-infiammatorie invece upregulated di segnalazione che comprendono le citochine quali l'interleuchina 17 ed il fattore di necrosi tumorale.

Ciò che trova indica la possibilità che l'eccessiva versione di citochina o “tempesta di citochina„ che è stata associata con COVID-19 severo potrebbe essere guidata dalle celle dello spettatore e che queste celle potrebbero servire da obiettivo terapeutico potenziale.

“Abbiamo mostrato un'applicazione potenziale di FD-seguente per lo studio del host che la risposta in un'infezione di coronavirus modella in vitro, che egualmente suggerisce il suo uso possibile nella ricerca pandemica COVID-19,„ scrive il gruppo.

Una tecnica utile per gli studi futuri

I ricercatori concludono che FD-seguente è uno strumento apprezzato per l'integrazione dell'attività della proteina con informazioni del transcriptome.

“I livelli e la fosforilazione di espressione di fattore di trascrizione possono essere integrati con l'intera analisi del transcriptome combinando la proteina intracellulare che macchia con FD-seguente,„ essi scrivono.

Ancora, “negli studi futuri, FD-seguenti potrebbe potenzialmente essere migliorato per l'ordinamento dei tessuti paraffina-incassati (FFPE) formalina-fissi, il risultato di cui avrebbe permesso all'ordinamento unicellulare di alto-capacità di lavorazione dei campioni disponibili facilmente in banche dei tessuti,„ conclude il gruppo.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Sally Robertson

Written by

Sally Robertson

Sally has a Bachelor's Degree in Biomedical Sciences (B.Sc.). She is a specialist in reviewing and summarising the latest findings across all areas of medicine covered in major, high-impact, world-leading international medical journals, international press conferences and bulletins from governmental agencies and regulatory bodies. At News-Medical, Sally generates daily news features, life science articles and interview coverage.

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