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O método arranjando em seqüência novo podia ser útil para a pesquisa COVID-19

Os pesquisadores na Universidade de Chicago e na clínica de Cleveland apresentaram um RNA novo da único-pilha que arranja em seqüência o método que poderia ser um pedido útil para a pesquisa na pandemia actual da doença 2019 do coronavirus (COVID-19).

A técnica, chamada FD-segs., é um método da alto-produção para arranjar em seqüência gota-baseado das únicas pilhas compatíveis com tratamento do paraformaldehyde (PFA).

Actualmente, único-pilha que arranja em seqüência os estudos que exigem a proteína que mancha ou inactivação do micróbio patogénico é limitado pelo facto de que os métodos da alto-produção não são compatíveis com tratamento de PFA, uma técnica amplamente utilizada para o tecido/fixação da pilha.

A técnica FD-segs. nova apresentada por Savaș Tay (a Universidade de Chicago) e colegas é particularmente útil para estudar subpopulações raras das pilhas que exigem a mancha intracelular da proteína e o Classificar-enriquecimento Fluorescência-Ativado (FACS) da pilha.

No estudo actual, a equipe usa-se FD-segs. para endereçar dois problemas importantes na virologia.

Em primeiro lugar, os pesquisadores investigaram os factores do anfitrião que apoiam o reactivation do herpesvirus sarcoma-associado de Kaposi (KSHV) em pilhas do tumor.

Em segundo lugar, usaram-se FD-segs. para explorar a resposta do anfitrião em um modelo in vitro da infecção do coronavirus OC43.

Este coronavirus é um parente do coronavirus respiratório agudo severo 2 (SARS-CoV-2), o agente que causa COVID-19, apontando desse modo ao uso potencial de FD-segs. para a pesquisa na pandemia actual.

Uma versão da pré-impressão do papel está disponível no bioRxiv* do server, quando o artigo se submeter à revisão paritária.

Desafios enfrentados no RNA da Único-pilha que arranja em seqüência estudos

o RNA da Único-pilha que arranja em seqüência (scRNA-segs.) tem aplicações amplas importantes, de descobrir tipos novos da pilha a traçar o transcriptome de células estaminais embrionárias.

as tecnologias scRNA-segs.s Gota-baseadas são incredibly poderosas, devido a sua produção alta, que permite a análise dos milhares de únicas pilhas em uma única experiência.

Contudo, mesmo com a disponibilidade destas técnicas da alto-produção, o estudo de populações raras da pilha permanece desafiante porque exige frequentemente o enriquecimento proteína-baseado da população da pilha.

Este enriquecimento pode às vezes ser conseguido usando os marcadores de superfície da pilha e o FACS. Ainda, alguns tipos da pilha exigem a proteína intracelular que mancha, e este significa frequentemente que a fixação com PFA é necessário aumentar a relação do sinal-à-fundo.

Contudo, a fixação de PFA apresenta um desafio no RNA que arranja em seqüência porque os ácidos nucleicos são ligados quimicamente às proteínas intracelulares.

“A fim recuperar o RNA de alta qualidade das únicas pilhas PFA-fixas, um protocolo apropriado da reversão da ligação transversal que mantivesse a integridade do RNA e minimizasse a perda do RNA fosse crucial,” disse Tay e colegas.

FD-segs. revela pilhas pro-inflamatórios do espectador após a infecção do coronavirus OC43. o t-SNE (do a-b) traça com as pilhas coloridas (a) pela identidade do conjunto ou (b) pelo tipo da amostra. (c) Barre o lote que mostra a porcentagem das pilhas contaminadas (definidas como as pilhas que expressaram pelo menos 1 transcrito viral) da zombaria contaminado e amostra do MOI 1. (d) O lote do violino que mostra a distribuição do transcrito viral total conta. (e) Lote do violino que mostra a distribuição da porcentagem do transcrito viral total pela identidade do conjunto. (f) Heatmap que mostra o nível relativo da expressão de cada gene viral de cada única pilha no conjunto 2. A linha azul mostra a porcentagem de cada pilha de transcritos virais totais. (g) O violino traça mostrar a expressão de quatro genes imune-relacionados representativos que upregulated no conjunto 0. (h) Barre o lote que mostra os P-valores ajustados de caminhos upregulated de KEGG nos conjuntos 1 e 2. A linha tracejada vertical indica o P-valor = 0,05.
FD-segs. revela pilhas pro-inflamatórios do espectador após a infecção do coronavirus OC43. o t-SNE (do a-b) traça com as pilhas coloridas (a) pela identidade do conjunto ou (b) pelo tipo da amostra. (c) Barre o lote que mostra a porcentagem das pilhas contaminadas (definidas como as pilhas que expressaram pelo menos 1 transcrito viral) da zombaria contaminado e amostra do MOI 1. (d) O lote do violino que mostra a distribuição do transcrito viral total conta. (e) Lote do violino que mostra a distribuição da porcentagem do transcrito viral total pela identidade do conjunto. (f) Heatmap que mostra o nível relativo da expressão de cada gene viral de cada única pilha no conjunto 2. A linha azul mostra a porcentagem de cada pilha de transcritos virais totais. (g) O violino traça mostrar a expressão de quatro genes imune-relacionados representativos que upregulated no conjunto 0. (h) Barre o lote que mostra os P-valores ajustados de caminhos upregulated de KEGG nos conjuntos 1 e 2. A linha tracejada vertical indica o P-valor = 0,05.

Que os pesquisadores fizeram?

Agora, a equipe mostrou que FD-segs. é um método particularmente útil da alto-produção para arranjar em seqüência gota-baseado do RNA das subpopulações raras da pilha que exigem a fixação de PFA.

A equipe usou o método para endereçar dois problemas desafiantes na virologia.

Primeiramente, investigaram os factores do anfitrião que influenciam reactivation sarcoma-associado do herpesvirus de Kaposi (KSHV) em pilhas do tumor.

Os pesquisadores dizem que há um interesse considerável em compreender os detalhes moleculars dos factores do anfitrião que modulam a latência e o reactivation de KSHV porque estes são sabidos para contribuir ao tumorigenesis viral. A indução terapêutica do reactivation podia sensibilizar pilhas lactente-contaminadas às anti-herpesvirus drogas actualmente disponíveis.

Usando FD-segs. para analisar uma população rara das pilhas que apoiam o reactivation de KSHV, a equipe identificou quatro genes do anfitrião - CDH1, CORO1C, ISCU, e TMEM119 - cujos os níveis correlacionaram fortemente com o reactivation viral.

Usando a imagem lactente da vivo-pilha e um estudo do tempo-curso da expressão genética viral, os pesquisadores encontraram que (proteína 119 da transmembrana) o gene TMEM119 teve o efeito o mais pronunciado em termos de induzir o reactivation de KSHV. Análise mais aprofundada por RNA-segs. maioria indicado que este efeito de TMEM119 pôde ser negociado com o caminho da sinalização de MAPK.

Aplicando a técnica a um parente de SARS-CoV-2

Em seguida, os pesquisadores investigaram a resposta imune de pilhas humanas do pulmão à infecção com coronavirus OC43, um parente de SARS-CoV-2 que causa a constipação comum.

“OC43 foi usado com sucesso para descobrir as drogas que inibem a réplica SARS-CoV-2 in vitro,” diz a equipe.

Depois da exposição ao vírus, a maioria de pilhas eram incapazes de apoiar um nível elevado de expressão genética viral e de caminhos imunes pro-inflamatórios pelo contrário upregulated da sinalização que envolvem cytokines tais como o interleukin 17 e o factor de necrose de tumor.

Isto que encontra aponta à possibilidade que a liberação do cytokine ou do “a tempestade excessiva cytokine” que foram associadas com o COVID-19 severo poderiam ser conduzidas por pilhas do espectador e que estas pilhas poderiam servir como um alvo terapêutico potencial.

“Nós mostramos uma aplicação potencial de FD-segs. para investigar o anfitrião que a resposta em uma infecção do coronavirus modelo in vitro, que igualmente sugira seu uso possível na pesquisa COVID-19 pandémica,” escreve a equipe.

Uma técnica útil para os estudos futuros

Os pesquisadores concluem que FD-segs. é uma ferramenta valiosa para integrar a actividade da proteína com informação do transcriptome.

Da “os níveis e a fosforilação da expressão de factor transcrição podem ser integrados com análise inteira do transcriptome combinando a proteína intracelular que mancha com o FD-segs.,” eles escrevem.

Além disso, “nos estudos futuros, FD-segs.s poderia potencial ser melhorado arranjando em seqüência tecidos parafina-encaixados (FFPE) formalina-fixos, a realização de que permitiria arranjar em seqüência da único-pilha da alto-produção de prontamente - as amostras disponíveis em bancos de tecido,” concluem a equipe.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Sally Robertson

Written by

Sally Robertson

Sally has a Bachelor's Degree in Biomedical Sciences (B.Sc.). She is a specialist in reviewing and summarising the latest findings across all areas of medicine covered in major, high-impact, world-leading international medical journals, international press conferences and bulletins from governmental agencies and regulatory bodies. At News-Medical, Sally generates daily news features, life science articles and interview coverage.

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