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O método arranjando em seqüência novo podia ser útil para a pesquisa COVID-19

Os pesquisadores na Universidade de Chicago e na clínica de Cleveland apresentaram um RNA novo da único-pilha que arranja em seqüência o método que poderia ser um pedido útil para a pesquisa na pandemia actual da doença 2019 do coronavirus (COVID-19).

A técnica, chamada FD-segs., é um método da alto-produção para arranjar em seqüência gota-baseado das únicas pilhas compatíveis com tratamento do paraformaldehyde (PFA).

Actualmente, único-pilha que arranja em seqüência os estudos que exigem a proteína que mancha ou inactivação do micróbio patogénico é limitado pelo facto de que os métodos da alto-produção não são compatíveis com tratamento de PFA, uma técnica amplamente utilizada para o tecido/fixação da pilha.

A técnica FD-segs. nova apresentada por Savaș Tay (a Universidade de Chicago) e colegas é particularmente útil para estudar subpopulações raras das pilhas que exigem a mancha intracelular da proteína e o Classificar-enriquecimento Fluorescência-Ativado (FACS) da pilha.

No estudo actual, a equipe usa-se FD-segs. para endereçar dois problemas importantes na virologia.

Em primeiro lugar, os pesquisadores investigaram os factores do anfitrião que apoiam o reactivation do herpesvirus sarcoma-associado de Kaposi (KSHV) em pilhas do tumor.

Em segundo lugar, usaram-se FD-segs. para explorar a resposta do anfitrião em um modelo in vitro da infecção do coronavirus OC43.

Este coronavirus é um parente do coronavirus respiratório agudo severo 2 (SARS-CoV-2), o agente que causa COVID-19, apontando desse modo ao uso potencial de FD-segs. para a pesquisa na pandemia actual.

Uma versão da pré-impressão do papel está disponível no bioRxiv* do server, quando o artigo se submeter à revisão paritária.

Desafios enfrentados no RNA da Único-pilha que arranja em seqüência estudos

o RNA da Único-pilha que arranja em seqüência (scRNA-segs.) tem aplicações amplas importantes, de descobrir tipos novos da pilha a traçar o transcriptome de células estaminais embrionárias.

as tecnologias scRNA-segs.s Gota-baseadas são incredibly poderosas, devido a sua produção alta, que permite a análise dos milhares de únicas pilhas em uma única experiência.

Contudo, mesmo com a disponibilidade destas técnicas da alto-produção, o estudo de populações raras da pilha permanece desafiante porque exige frequentemente o enriquecimento proteína-baseado da população da pilha.

Este enriquecimento pode às vezes ser conseguido usando os marcadores de superfície da pilha e o FACS. Ainda, alguns tipos da pilha exigem a proteína intracelular que mancha, e este significa frequentemente que a fixação com PFA é necessário aumentar a relação do sinal-à-fundo.

Contudo, a fixação de PFA apresenta um desafio no RNA que arranja em seqüência porque os ácidos nucleicos são ligados quimicamente às proteínas intracelulares.

“A fim recuperar o RNA de alta qualidade das únicas pilhas PFA-fixas, um protocolo apropriado da reversão da ligação transversal que mantivesse a integridade do RNA e minimizasse a perda do RNA fosse crucial,” disse Tay e colegas.

FD-segs. revela pilhas pro-inflamatórios do espectador após a infecção do coronavirus OC43. o t-SNE (do a-b) traça com as pilhas coloridas (a) pela identidade do conjunto ou (b) pelo tipo da amostra. (c) Barre o lote que mostra a porcentagem das pilhas contaminadas (definidas como as pilhas que expressaram pelo menos 1 transcrito viral) da zombaria contaminado e amostra do MOI 1. (d) O lote do violino que mostra a distribuição do transcrito viral total conta. (e) Lote do violino que mostra a distribuição da porcentagem do transcrito viral total pela identidade do conjunto. (f) Heatmap que mostra o nível relativo da expressão de cada gene viral de cada única pilha no conjunto 2. A linha azul mostra a porcentagem de cada pilha de transcritos virais totais. (g) O violino traça mostrar a expressão de quatro genes imune-relacionados representativos que upregulated no conjunto 0. (h) Barre o lote que mostra os P-valores ajustados de caminhos upregulated de KEGG nos conjuntos 1 e 2. A linha tracejada vertical indica o P-valor = 0,05.
FD-segs. revela pilhas pro-inflamatórios do espectador após a infecção do coronavirus OC43. o t-SNE (do a-b) traça com as pilhas coloridas (a) pela identidade do conjunto ou (b) pelo tipo da amostra. (c) Barre o lote que mostra a porcentagem das pilhas contaminadas (definidas como as pilhas que expressaram pelo menos 1 transcrito viral) da zombaria contaminado e amostra do MOI 1. (d) O lote do violino que mostra a distribuição do transcrito viral total conta. (e) Lote do violino que mostra a distribuição da porcentagem do transcrito viral total pela identidade do conjunto. (f) Heatmap que mostra o nível relativo da expressão de cada gene viral de cada única pilha no conjunto 2. A linha azul mostra a porcentagem de cada pilha de transcritos virais totais. (g) O violino traça mostrar a expressão de quatro genes imune-relacionados representativos que upregulated no conjunto 0. (h) Barre o lote que mostra os P-valores ajustados de caminhos upregulated de KEGG nos conjuntos 1 e 2. A linha tracejada vertical indica o P-valor = 0,05.

Que os pesquisadores fizeram?

Agora, a equipe mostrou que FD-segs. é um método particularmente útil da alto-produção para arranjar em seqüência gota-baseado do RNA das subpopulações raras da pilha que exigem a fixação de PFA.

A equipe usou o método para endereçar dois problemas desafiantes na virologia.

Primeiramente, investigaram os factores do anfitrião que influenciam reactivation sarcoma-associado do herpesvirus de Kaposi (KSHV) em pilhas do tumor.

Os pesquisadores dizem que há um interesse considerável em compreender os detalhes moleculars dos factores do anfitrião que modulam a latência e o reactivation de KSHV porque estes são sabidos para contribuir ao tumorigenesis viral. A indução terapêutica do reactivation podia sensibilizar pilhas lactente-contaminadas às anti-herpesvirus drogas actualmente disponíveis.

Usando FD-segs. para analisar uma população rara das pilhas que apoiam o reactivation de KSHV, a equipe identificou quatro genes do anfitrião - CDH1, CORO1C, ISCU, e TMEM119 - cujos os níveis correlacionaram fortemente com o reactivation viral.

Usando a imagem lactente da vivo-pilha e um estudo do tempo-curso da expressão genética viral, os pesquisadores encontraram que (proteína 119 da transmembrana) o gene TMEM119 teve o efeito o mais pronunciado em termos de induzir o reactivation de KSHV. Análise mais aprofundada por RNA-segs. maioria indicado que este efeito de TMEM119 pôde ser negociado com o caminho da sinalização de MAPK.

Aplicando a técnica a um parente de SARS-CoV-2

Em seguida, os pesquisadores investigaram a resposta imune de pilhas humanas do pulmão à infecção com coronavirus OC43, um parente de SARS-CoV-2 que causa a constipação comum.

“OC43 foi usado com sucesso para descobrir as drogas que inibem a réplica SARS-CoV-2 in vitro,” diz a equipe.

Depois da exposição ao vírus, a maioria de pilhas eram incapazes de apoiar um nível elevado de expressão genética viral e de caminhos imunes pro-inflamatórios pelo contrário upregulated da sinalização que envolvem cytokines tais como o interleukin 17 e o factor de necrose de tumor.

Isto que encontra aponta à possibilidade que a liberação do cytokine ou do “a tempestade excessiva cytokine” que foram associadas com o COVID-19 severo poderiam ser conduzidas por pilhas do espectador e que estas pilhas poderiam servir como um alvo terapêutico potencial.

“Nós mostramos uma aplicação potencial de FD-segs. para investigar o anfitrião que a resposta em uma infecção do coronavirus modelo in vitro, que igualmente sugira seu uso possível na pesquisa COVID-19 pandémica,” escreve a equipe.

Uma técnica útil para os estudos futuros

Os pesquisadores concluem que FD-segs. é uma ferramenta valiosa para integrar a actividade da proteína com informação do transcriptome.

Da “os níveis e a fosforilação da expressão de factor transcrição podem ser integrados com análise inteira do transcriptome combinando a proteína intracelular que mancha com o FD-segs.,” eles escrevem.

Além disso, “nos estudos futuros, FD-segs.s poderia potencial ser melhorado arranjando em seqüência tecidos parafina-encaixados (FFPE) formalina-fixos, a realização de que permitiria arranjar em seqüência da único-pilha da alto-produção de prontamente - as amostras disponíveis em bancos de tecido,” concluem a equipe.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Sally Robertson

Written by

Sally Robertson

Sally first developed an interest in medical communications when she took on the role of Journal Development Editor for BioMed Central (BMC), after having graduated with a degree in biomedical science from Greenwich University.

Citations

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