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El método de secuencia nuevo podía ser útil para la investigación COVID-19

Los investigadores en la Universidad de Chicago y la clínica de Cleveland han presentado un ARN unicelular nuevo que ordenaba el método que podría ser un uso útil para la investigación en el pandémico actual de la enfermedad 2019 del coronavirus (COVID-19).

La técnica, llamada FD-seq, es un método de la alto-producción para la secuencia gotita-basada de las células compatibles con el tratamiento del paraformaldehido (PFA).

Actualmente, estudios de secuencia unicelulares que requieren la proteína que mancha o desactivación el patógeno es limitado por el hecho de que los métodos de la alto-producción no son compatibles con el tratamiento de PFA, una técnica ampliamente utilizada para el tejido/la fijación de la célula.

La nueva técnica FD-seq presentada por Savaș Tay (la Universidad de Chicago) y colegas es determinado útil para estudiar subpoblaciones raras de células que requieran la coloración intracelular de la proteína y el Clasificación-enriquecimiento Fluorescencia-Activado (FACS) de la célula.

En el estudio actual, las personas utilizan FD-seq para abordar dos problemas importantes en virología.

En primer lugar, los investigadores investigaron los factores del ordenador principal que soportan la reactivación del herpesvirus sarcoma-asociado de Kaposi (KSHV) en células del tumor.

En segundo lugar, utilizaron FD-seq para explorar la reacción del ordenador principal en un modelo in vitro de la infección del coronavirus OC43.

Este coronavirus es un pariente del coronavirus respiratorio agudo severo 2 (SARS-CoV-2), el agente que causa COVID-19, de tal modo apuntando al uso potencial de FD-seq para la investigación en el pandémico actual.

Una versión de la prueba preliminar del papel está disponible en el bioRxiv* del servidor, mientras que el artículo experimenta la revisión paritaria.

Retos hechos frente en el ARN unicelular que ordena estudios

El ARN unicelular que ordena (scRNA-seq) tiene usos amplios importantes, de descubrir nuevos tipos de la célula a correlacionar el transcriptome de células madres embrionarias.

las tecnologías scRNA-seq Gotita-basadas son increíblemente potentes, debido a su alta producción, que habilita el análisis de millares de células en un único experimento.

Sin embargo, incluso con la disponibilidad de estas técnicas de la alto-producción, el estudio de las poblaciones raras de la célula sigue siendo desafiador porque requiere a menudo el enriquecimiento a base de proteínas de la población de la célula.

Este enriquecimiento se puede lograr a veces usando marcadores de la superficie de la célula y FACS. No obstante, algunos tipos de la célula requieren la proteína intracelular que mancha, y éste significa a menudo que la fijación con PFA es necesaria aumentar la índice del señal-a-fondo.

Sin embargo, la fijación de PFA presenta un reto en el ARN que ordena porque los ácidos nucléicos químicamente se reticulan a las proteínas intracelulares.

“Para extraer el ARN de alta calidad de las únicas células PFA-fijas, un protocolo apropiado de la revocación de la interconexión que mantiene integridad del ARN y disminuye baja del ARN es crucial,” dijo Tay y a colegas.

FD-seq revela las células favorable-inflamatorias del espectador después de la infección del coronavirus OC43. el t-SNE (del a-b) traza con las células coloreadas por (a) identidad del atado o (b) el tipo de la muestra. (c) Barre el gráfico que muestra el porcentaje de las células infectadas (definidas como células que expresaron por lo menos 1 transcripción viral) de la mofa infectada y muestra del MOI 1. (d) El gráfico del violín que muestra la distribución de la transcripción viral total cuenta. (e) Gráfico del violín que muestra la distribución del porcentaje de la transcripción viral total por identidad del atado. (f) Heatmap que muestra el nivel relativo de la expresión de cada gen viral de cada célula en el atado 2. La línea azul muestra el porcentaje de cada célula de transcripciones virales totales. El violín del (G) traza el mostrar de la expresión de cuatro genes inmune-relacionados representativos que upregulated en el atado 0. (h) Barre el gráfico que muestra los P-valores ajustados de los caminos upregulated de KEGG en los atados 1 y 2. La línea discontinua vertical indica P-valor = 0,05.
FD-seq revela las células favorable-inflamatorias del espectador después de la infección del coronavirus OC43. el t-SNE (del a-b) traza con las células coloreadas por (a) identidad del atado o (b) el tipo de la muestra. (c) Barre el gráfico que muestra el porcentaje de las células infectadas (definidas como células que expresaron por lo menos 1 transcripción viral) de la mofa infectada y muestra del MOI 1. (d) El gráfico del violín que muestra la distribución de la transcripción viral total cuenta. (e) Gráfico del violín que muestra la distribución del porcentaje de la transcripción viral total por identidad del atado. (f) Heatmap que muestra el nivel relativo de la expresión de cada gen viral de cada célula en el atado 2. La línea azul muestra el porcentaje de cada célula de transcripciones virales totales. El violín del (G) traza el mostrar de la expresión de cuatro genes inmune-relacionados representativos que upregulated en el atado 0. (h) Barre el gráfico que muestra los P-valores ajustados de los caminos upregulated de KEGG en los atados 1 y 2. La línea discontinua vertical indica P-valor = 0,05.

¿Qué los investigadores hicieron?

Ahora, las personas han mostrado que FD-seq es un método determinado útil de la alto-producción para la secuencia gotita-basada del ARN de las subpoblaciones raras de la célula que requieren la fijación de PFA.

Las personas utilizaron el método para abordar dos problemas desafiadores en virología.

Primero, investigaron los factores del ordenador principal que influencian la reactivación sarcoma-asociada del herpesvirus de Kaposi (KSHV) en células del tumor.

Los investigadores dicen que hay considerable interés en la comprensión de los detalles moleculares de los factores del ordenador principal que modulan tiempo de espera y la reactivación de KSHV porque éstos se saben para contribuir al tumorigenesis viral. La inducción terapéutica de la reactivación podía sensibilizar las células latente-infectadas a las drogas antis-herpesvirus actualmente disponibles.

Usando FD-seq para analizar una población rara de células que soportan la reactivación de KSHV, las personas determinaron cuatro genes del ordenador principal - CDH1, CORO1C, ISCU, y TMEM119 - cuyos niveles correlacionaron fuertemente con la reactivación viral.

Usando proyección de imagen de la vivo-célula y un estudio del tiempo-curso de la expresión génica viral, los investigadores encontraron que (proteína 119 de la transmembrana) el gen TMEM119 tenía el efecto más pronunciado en términos de inducir la reactivación de KSHV. Análisis adicional por ARN-seq a granel indicada que este efecto de TMEM119 se pudo mediar con el camino de la transmisión de señales de MAPK.

Aplicación de la técnica a un pariente de SARS-CoV-2

Después, los investigadores investigaron la inmunorespuesta de las células humanas del pulmón a la infección con el coronavirus OC43, pariente de SARS-CoV-2 que causa el frío común.

“OC43 se ha utilizado con éxito para descubrir las drogas que inhiben la réplica SARS-CoV-2 in vitro,” dice a las personas.

Después de la exposición al virus, la mayoría de las células no podían soportar un de alto nivel de la expresión génica viral y de los caminos inmunes favorable-inflamatorios en lugar de otro upregulated de la transmisión de señales que implicaban cytokines tales como interleukin 17 y factor de necrosis de tumor.

Esto que encuentra apunta a la posibilidad que la baja del cytokine o la “tormenta excesiva del cytokine” que se ha asociado a COVID-19 severo se podrían impulsar por las células del espectador y que podrían servir estas células como objetivo terapéutico potencial.

“Mostramos un uso potencial de FD-seq para investigar el ordenador principal que la reacción en una infección del coronavirus modelo in vitro, que también sugiere su uso posible en la investigación pandémica COVID-19,” escriba a las personas.

Una técnica útil para los estudios futuros

Los investigadores concluyen que FD-seq es una herramienta valiosa para integrar actividad de la proteína con la información del transcriptome.

“Los niveles y la fosforilación de la expresión de factor de la transcripción se pueden integrar con análisis entero del transcriptome combinando la proteína intracelular que mancha con FD-seq,” ellos escriben.

Además, “en los estudios futuros, FD-seq se podría potencialmente perfeccionar para ordenar tejidos parafina-embutidos (FFPE) formalina-fijos, el logro cuyo habilitaría la secuencia unicelular de la alto-producción de muestras fácilmente disponibles en las inclinaciones laterales de tejido,” concluye a las personas.

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
Sally Robertson

Written by

Sally Robertson

Sally has a Bachelor's Degree in Biomedical Sciences (B.Sc.). She is a specialist in reviewing and summarising the latest findings across all areas of medicine covered in major, high-impact, world-leading international medical journals, international press conferences and bulletins from governmental agencies and regulatory bodies. At News-Medical, Sally generates daily news features, life science articles and interview coverage.

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