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Entrée microbody des cases SARS-CoV-2 du soluble ACE2 dans des cellules de poumon

Car la pandémie COVID-19 continue à s'étendre à beaucoup de parties du monde, il y a un besoin urgent pour un vaccin préventif et une thérapeutique améliorée. Une étude neuve par des chercheurs à la faculté de médecine de centre médical et de Weill Cornell de NYU Langone et à publié sur le bioRxiv* de serveur de prétirage indique en septembre 2020 le potentiel d'une enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2) - composé de Fc d'anticorps dans un format neuf qui semble offrir une inhibition plus significative de SARS-CoV-2.

ACE2 a été l'un des objectifs principaux thérapeutique et de vaccin de mise au point à cause de son rôle intrinsèque dans la pièce d'assemblage virale par l'intermédiaire de la glycoprotéine de pointe et d'entrée dans la cellule hôte. Le blocage de cette première étape pourrait éviter l'infection totalement, et est une intervention facile due à l'emplacement de l'objectif sur la surface de la cellule, qui évite le besoin d'entrée de cellules.

Récepteurs ACE2 solubles

La première recherche a examiné l'utilisation des récepteurs solubles pour HIV-1, puisque le grippement viral aux récepteurs CD4 par l'intermédiaire de la glycoprotéine gp120competitively d'enveloppe empêche sa pièce d'assemblage au récepteur à cellule T de l'objectif CD4, évite de ce fait l'entrée virale. Les études in vitro ont confirmé ce mécanisme d'inhibition virale.

Quand la protéine a été protégée par fusible à la partie de Fc d'une molécule d'immunoglobuline, pour former un immunoadhesin, les dimères gp120 ont été formés, avec l'avidité sensiblement accrue. Ceci a été montré, in vivo, pour avoir comme conséquence une plus longue durée de la survie de protéine dans le fuselage.

Le type sauvage et les protéines microbody de H345A ACE2 sont les dimères collés par bisulfure. (a) Les domaines d
Le type sauvage et les protéines microbody de H345A ACE2 sont les dimères collés par bisulfure. (a) Les domaines d'ACE2 sont montrés avec les structures du soluble ACE2 (sACE2), ACE2 microbody et les protéines microbody d'ACE2.H345A ci-dessous. Les protéines du soluble ACE2 sont effacées pour la transmembrane (TM) et les domaines cytoplasmiques. Les protéines ACE2 microbody sont protégées par fusible au domaine humain chacun d'IgG CH3 avec un 8XHis-tag carboxyterminal. IC : domaine intracellulaire.

Plus tard, une autre modification a été apportée, en plus d'un peptide viral du coreceptor CCR5-derived à l'immunoadhesin de CD4-Ig. Ceci prouvé pour être un inhibiteur viral efficace, se protégeant contre l'infection dans des modèles animaux.

Les affaires de papier actuelles avec un récepteur soluble assimilé s'approchent à bloquer l'entrée SARS-CoV-2, basée sur la protéine humaine recombinée du soluble ACE2 (hrsACE2) ou le hrsACE2-IgG, qui ont l'ACE2 lié au l'IG-FC. Les deux ont été montrés plus tôt pour éviter l'infection avec Radars à ouverture synthétique-CoV et SARS-CoV-2 dans un modèle de souris.

Dans des tests cliniques de la phase 1 et de la phase 2, cette protéine a montré le blocage partiel de l'activité virale mais a été rapidement retirée de la circulation. La demi vie s'est améliorée in vivo en plus de la partie de Fc. Cependant, ceci soulève des inquiétudes pour les possibilités de la maladie sévère dues à l'amélioration dépendante des anticorps à cause de la présence du Fc. Le récepteur de Fc se produit naturellement sur des cellules immunitaires et est le site de la pièce d'assemblage de l'anticorps d'anti-pointe, menant à l'entrée virale accrue dans ces cellules.

Protéine d'ACE2 Microbody

Pour éviter ceci, les chercheurs actuels explorés utilisant un être humain soluble ACE2 « microbody » dans ce que la molécule ACE2 est protégée par fusible au réseau lourd Fc d'Ig par l'ectodomain de l'ancien. L'ectodomain préserve les résidus de cystéine, permettant à des dimères de protéine de former, avec une affinité plus grande de gripper pour le virus, même tout en réduisant sa masse moléculaire. Les dimères du soluble ACE2 et les dimères ACE2 microbody sont liés par des liaisons disulfide du non-bisulfure et.

Les chercheurs ont constaté que ce microbody pour gripper au récepteur de Fc sur la surface de cellule immunitaire et pour cette raison, ne provoquera pas ADE. L'activité antivirale du microbody était dix fois plus haut que cela du soluble ACE2, bien que les deux aient été des dimères. Elle a également eu une affinité plus élevée pour le grippement de virion. Dans la culture de tissu, elle a persisté pendant un plus long temps que le soluble ACE2.

Elle a également bloqué l'entrée de virus sur une gamme des lignées cellulaires, pour la variante originelle de pointe et la variante dominante de D614G, ainsi que d'autres dans une Commission des bêta-coronavirus clouent des protéines.

Prévention de l'activité catalytique ACE2

Les chercheurs ont trouvé que cela l'introduction d'une mutation du détail H345A afin d'empêcher le soluble ACE2 d'exercer son activité enzymatique catalytique n'a pas influencé son affinité pour la protéine de S. C'est nécessaire pour éviter ses effets sur la pression sanguine.

Pseudovirus comporte le DS avec le pouvoir infectant accru

Pseudoviruses exprimant un mutant d'omission de la protéine de pointe qui retire la séquence putative d'assemblage d'ER qui évite le transfert de la protéine de S sur la surface de cellules a eu 20 ou plus cale des niveaux plus élevés de protéine de S que ceux qui ont exprimé la protéine intégrale de S. Le nombre de virions était assimilé, cependant. La raison de la performance accrue de l'emballage de DS est vraisemblablement la perte d'inhibition de l'arrière cytoplasmique d'ER sur la constitution de S dans le virion puisque les deux sont presque également exprimés sur la surface de cellules.

Les chercheurs ont également constaté que les pseudoviruses exprimant la protéine de S bondissent particulièrement aux protéines microbody du soluble ACE2. Ce grippement a été empêché par le sérum humain convalescent avec un titre élevé d'anticorps. Le mutant ACE2 microbody (wildtype et soluble) bondissent aux virions plus efficacement que la protéine microbody de wildtype, quoique l'acide aminé muté ne soit pas sur la surface, qui agit l'un sur l'autre avec la protéine de pointe.

ACE2 Microbody bloque l'infection de SARS-CoV-2 Pseudovirus

Les chercheurs ont examiné la capacité du soluble ACE2 et l'ACE2 microbody d'éviter la réplication de pseudovirus de SARS-CoV-2 DS, utilisant une borne de teinture fluorescente. Ils ont constaté que tandis que le soluble ACE2 avait l'activité antivirale modérée, le microbody était beaucoup plus puissant, alors que le microbody muté avait l'activité inhibitrice hautement efficace. La concentration antivirale efficace EC50 était 1,24 μg/ml, 0,36 μg/ml et 0,15 μg/ml pour le soluble ACE2, l'ACE2 microbody et l'ACE2 muté microbody, respectivement.

L'activité du soluble ACE2 est assimilée à celle du sérum convalescent et empêche expressément la protéine de la pointe SARS-CoV-2.

Ils infectés une lignée cellulaire avec SARS-CoV-2 conçu sous tension contenant un gène de borne de teinture fluorescente dans ORF7 de sorte que sa réplication ait pu être surveillée. Ils ont constaté qu'aux dilutions séquentielles, l'activité ACE2 antivirale maintenue microbody du μg 1-0.125. Avec le soluble ACE2, avec un EC50 de 1 μg, l'activité a été détruite à 0,5 μg. Type sauvage et ACE2 muté EC50 assimilé ici montré microbody, étant supérieur au soluble ACE2.

Ils ont alors déterminé que les protéines microbody seraient en activité une fois exposées au virus aux remarques postérieures de temps aussi bien, avec l'ancien étant ajouté simultanément ou jusqu'à 6 heures après infection. Ceci a eu comme conséquence l'inhibition de 80% quand les deux ont été ajoutés simultanément, presque les mêmes à 30 mn de l'infection et 55% à 2 heures où environ 10% du virus infectieux est lié à la cellule. L'activité s'est affaiblie ensuite cela.

Ainsi, l'ACE2 microbody peut bloquer l'infection si actuel avant le virus grippant à la cellule cible, ou au moment de l'exposition, et même de jusqu'à 2 heures suivant l'exposition. Cet hublot de temps indique la période l'où le virus n'a pas encore sensiblement lié à la cellule.

D'ailleurs, même peu après que le virus ait été lié, des taux d'infection pourraient être abaissés par l'incubation avec l'ACE2 microbody pour 30 mn suivantes. Le régime du virus grippant au récepteur ACE2 s'est avéré dépendant du temps, avec beaucoup plus de grippement à 4 heures de comparé à 1 heure d'incubation, peut-être parce que seulement quelques interactions spike-ACE2 se produisent au début, suivi des protéines complémentaires de S entrant dans le grippement au fil du temps. Car ce dernier se produit, les microbodies ACE2 ne peuvent plus empêcher l'entrée virale.

ACE2 Microbody bloque la variante de D614G

Une variante de SARS-CoV-2 contenant une mutation ponctuelle de D614G dans la protéine de S est connue pour devenir la variante dominante partout où elle apparaît rapidement. Elle est associée au pouvoir infectant accru. Le pseudovirus de DS contenant cette mutation est également bloqué modérément par le soluble ACE2, alors que le wildtype et le mutant ACE2 microbody sont plus efficaces à la réplication virale inhibante avec cette variante.  Une comparaison des deux types de pseudoviruses au sujet de gripper prouvé que le soluble ACE2 grippe la variante pointe-transportante de D614G plus efficacement, tandis que

Grippages d'ACE2 Microbody à d'autres protéines de pointe de Betacoronavirus

Les protéines microbody d'ACE2 et de H345A ont évité l'entrée de tous les pseudoviruses transportant différentes protéines de pointe de betacoronavirus, indiquant un spectre grand d'anti-betacoronavirus tandis que le soluble ACE2 avait l'activité antivirale inférieure.

Implications

L'ACE2 microbody est plus en activité de 10 fois que le soluble ACE2 contre SARS-CoV-2 et a une affinité quadruple aux particules virales. Son origine humaine signifie que son immunogénicité est inférieure. Elle semble également avoir l'efficacité grande contre des variantes apparaissantes de pointe, y compris la mutation de D614G.

Les chercheurs ont introduit une mutation spécifique dans l'ACE2 microbody pour éliminer l'activité catalytique de l'enzyme tout en préservant son activité antivirale. Cette mutation a semblé augmenter l'activité du potentiel microbody mais pas son d'inhibition dans l'analyse sous tension de virus.

Les chercheurs proposent également que le microbody puisse avoir une activité antivirale plus significative qu'observée ici parce que la plupart des expériences ont été effectuées sur les cellules qui expriment des hauts niveaux d'ACE2. Une fois analysé sur une lignée cellulaire avec les niveaux très bas ACE2, l'ACE2 microbody a eu une activité plus antivirale.

Les chercheurs résument, « l'entrée ACE2 inhibée par protéine microbody bisulfure-métallisée SARS-CoV-2 du virus pseudotyped par protéine lentiviral de la pointe et SARS-CoV-2 sous tension avec un soluble que non modifié plus élevé ACE2 de pouvoir 10 fois et étaient en activité après le virus initial grippant à la cellule. »

L'étude prouve également que la protéine de D614G S s'entretient un pouvoir infectant plus élevé et une affinité plus élevée pour ACE2. Cependant, l'ACE2 microbody pouvait neutraliser le pseudovirus contenant cette variante de pointe, ainsi que d'autres protéines de pointe de betacoronavirus. Ceci pourrait indiquer que cette technologie peut être employée pour neutraliser les coronaviruses apparaissants neuf qui grippent au récepteur ACE2 aussi bien, activant son utilisation comme « réactif disponible sur le marché qui pourrait être rapidement déployé.'

Avis *Important

le bioRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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