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ACE2 entrata microbody solubile dei blocchi SARS-CoV-2 nelle celle del polmone

Poichè la pandemia COVID-19 continua a spargersi in molte parti del mondo, c'è un bisogno urgente per un vaccino preventivo e una terapeutica migliore. Un nuovo studio dai ricercatori al centro medico di NYU Langone ed all'istituto universitario medico di Weill Cornell e pubblicato sul bioRxiv* del " server " della pubblicazione preliminare nel settembre 2020 riferisce il potenziale di un enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2) - complesso di Fc dell'anticorpo in un nuovo formato che sembra offrire l'inibizione più significativa di SARS-CoV-2.

ACE2 è stato uno degli obiettivi principali di sviluppo del vaccino e terapeutici a causa del suo ruolo intrinseco in collegamento virale via la glicoproteina della punta e dell'entrata nella cellula ospite. Il blocco del questo primo punto potrebbe impedire l'infezione complessivamente ed è un intervento facile dovuto la posizione dell'obiettivo sulla superficie della cella, che evita l'esigenza dell'entrata delle cellule.

Ricevitori solubili ACE2

La ricerca iniziale ha esaminato l'uso dei ricevitori solubili per il HIV-1, poiché l'associazione virale ai recettori CD4 via la glicoproteina gp120competitively della busta inibisce il suo collegamento al recettore delle cellule t dell'obiettivo CD4, quindi impedisce l'entrata virale. Gli studi in vitro hanno confermato questo meccanismo di inibizione virale.

Quando la proteina è stata fusa alla parte di Fc di molecola dell'immunoglobulina, per formare un immunoadhesin, i dimeri gp120 sono stati formati, con l'avidità significativamente aumentata. Ciò è stata indicata, in vivo, per provocare una durata più lunga della sopravvivenza della proteina nell'organismo.

le proteine microbody di H345A e Selvaggio tipe ACE2 sono dimeri tenuti da adesivo bisolfuro. (A) I domini di ACE2 sono indicati con le strutture del ACE2 solubile (sACE2), di ACE2 microbody e proteine microbody di ACE2.H345A qui sotto. Le proteine solubili ACE2 sono cancellate per il transmembrane ed i domini citoplasmici. Le proteine microbody ACE2 sono fuse al dominio umano ciascuno di IgG CH3 con un 8XHis-tag carboxyterminal. IC: dominio intracellulare.
le proteine microbody di H345A e Selvaggio tipe ACE2 sono dimeri tenuti da adesivo bisolfuro. (A) I domini di ACE2 sono indicati con le strutture del ACE2 solubile (sACE2), di ACE2 microbody e proteine microbody di ACE2.H345A qui sotto. Le proteine solubili ACE2 sono cancellate per il transmembrane (TM) ed i domini citoplasmici. Le proteine microbody ACE2 sono fuse al dominio umano ciascuno di IgG CH3 con un 8XHis-tag carboxyterminal. IC: dominio intracellulare.

Più successivamente, un'altra modifica è stata apportata, con l'aggiunta di un peptide virale di coreceptor CCR5-derived al immunoadhesin di CD4-Ig. Ciò rivelata essere un inibitore virale potente, proteggente dall'infezione nei modelli animali.

Gli affari di carta correnti con un simile ricevitore solubile si avvicinano a a bloccare l'entrata SARS-CoV-2, in base alla proteina umana recombinante della sostanza solubile ACE2 (hrsACE2) o a hrsACE2-IgG, che hanno il ACE2 limitato a Ig-Fc. Entrambi sono stati indicati più presto per impedire l'infezione con SAR-CoV e SARS-CoV-2 in un modello del mouse.

Nei test clinici di fase 1 e di fase 2, questa proteina ha mostrato la didascalia parziale dell'attività virale ma rapidamente è stata eliminata da circolazione. L'emivita è migliorato in vivo con l'aggiunta della parte di Fc. Tuttavia, questo suscita inquietudini quanto alle probabilità della malattia severa dovuto il potenziamento dipendente dall'anticorpo a causa della presenza del Fc. Il ricevitore di Fc si presenta naturalmente sulle celle immuni ed è il sito del collegamento dell'anticorpo della anti-punta, piombo all'entrata virale aumentata in queste celle.

Proteina di ACE2 Microbody

per impedire questo, i ricercatori correnti esplorati facendo uso di un essere umano solubile ACE2 “microbody„ in cui la molecola ACE2 è fusa alla catena pesante Fc di Ig attraverso il ectodomain del precedente. Il ectodomain conserva i residui della cisteina, permettendo che i dimeri della proteina si formino, con una maggior affinità dell'associazione per il virus, anche mentre diminuisce il suo Massachusetts molecolare. I dimeri solubili ACE2 ed i dimeri microbody ACE2 sono tenuti insieme dai legami bisolfurico e del non bisolfuro.

I ricercatori hanno trovato che questo microbody non riuscito per legare al ricevitore di Fc sulla superficie delle cellule immuni e quindi, non provocherà ADE. L'attività antivirale del microbody era dieci volte più superiore a quella di ACE2 solubile, sebbene entrambi fossero dimeri. Egualmente ha avuta un'più alta affinità per l'associazione di virion. Nella cultura del tessuto, ha persistito per un tempo maggiore che ACE2 solubile.

Egualmente ha bloccato l'entrata del virus sopra un intervallo delle linee cellulari, per la variante originale della punta e la variante dominante di D614G come pure altre in un comitato di beta-coronavirus proteine della punta.

Impedire attività catalitica ACE2

I ricercatori hanno trovato che quello introdurre una mutazione specifica di H345A per impedire il ACE2 solubile esercitare la sua attività enzimatica catalitica non ha urtato la sua affinità per la proteina di S. Ciò è necessaria da impedire i sui effetti su pressione sanguigna.

Pseudovirus incorpora il DS con infettività aumentata

Pseudoviruses che esprime un mutante di eliminazione della proteina della punta che elimina la sequenza presunta della conservazione di ER che impedisce la migrazione della proteina di S alla superficie delle cellule ha avuto 20 o più cronometra i livelli elevati della proteina di S che quelle che hanno espresso la proteina integrale di S. Il numero dei virions era simile, tuttavia. La ragione per il risparmio di temi aumentato dell'imballaggio di DS è probabilmente la perdita di inibizione della coda citoplasmica di ER sull'incorporazione di S nel virion poiché entrambi sono espressi quasi ugualmente alla superficie delle cellule.

I ricercatori egualmente hanno trovato che gli pseudoviruses che esprimono la proteina di S specificamente limitano alle proteine microbody solubili ACE2. Questa associazione è stata inibita dal siero umano convalescente con un alto titolo dell'anticorpo. Il mutante ACE2 microbody (sia wildtype che sostanza solubile) limita più efficientemente ai virions della proteina microbody del wildtype, anche se l'amminoacido mutato non è alla superficie, che interagisce con la proteina della punta.

ACE2 Microbody blocca l'infezione di SARS-CoV-2 Pseudovirus

I ricercatori hanno esaminato la capacità del ACE2 solubile e del ACE2 microbody di impedire la replica di pseudovirus di SARS-CoV-2 DS, facendo uso di un indicatore della tintura fluorescente. Hanno trovato che mentre ACE2 solubile ha avuto attività antivirale moderata, il microbody era molto più potente, mentre il microbody mutato ha avuto attività inibitoria altamente potente. L'efficace concentrazione antivirale EC50 era 1,24 μg/ml, 0,36 μg/ml e 0,15 μg/ml per il ACE2 solubile, il ACE2 microbody e il ACE2 mutato microbody, rispettivamente.

L'attività del ACE2 solubile è simile a quella del siero convalescente ed inibisce esplicitamente la proteina della punta SARS-CoV-2.

Hanno infettato una linea cellulare con SARS-CoV-2 costruito in tensione che contiene un gene dell'indicatore della tintura fluorescente in ORF7 in modo che la sua replica potesse essere riflessa. Hanno trovato che alle diluizioni seriali, l'attività antivirale conservata microbody ACE2 da μg 1-0.125. Con ACE2 solubile, con un EC50 di 1 μg, l'attività è stata persa a 0,5 μg. Sia ACE2 selvaggio tipo che mutato simile EC50 qui indicato microbody, essendo superiore a ACE2 solubile.

Poi hanno determinato che le proteine microbody sarebbero state attive una volta esposte al virus ai punti successivi di tempo pure, con il precedente che si è aggiunto simultaneamente o fino a 6 ore dopo l'infezione. Ciò ha provocato l'inibizione di 80% quando entrambi si sono aggiunti simultaneamente, quasi lo stessi a 30 minuti dall'infezione e 55% a 2 ore in cui circa 10% del virus contagioso è limitato alla cella. L'attività ha calato dopo quello.

Quindi, il ACE2 microbody può bloccare l'infezione se presente prima del virus che lega alla cellula bersaglio, o ai tempi dell'esposizione e perfino di fino a 2 ore che seguono l'esposizione. Questa finestra di tempo indica il periodo in cui il virus non ha limitato ancora significativamente alla cella.

Inoltre, anche presto dopo che il virus è stato limitato, i gradi di infezione potrebbero essere abbassati incubando con il ACE2 microbody per i 30 minuti prossimi. La tariffa del virus che lega al ricevitore ACE2 è risultata dipendente dal tempo, con molto più associazione a 4 ore confrontate a 1 ora di incubazione, forse perché soltanto alcune interazioni spike-ACE2 accadono inizialmente, seguito dalle proteine supplementari di S che prendparteono col passare del tempo all'associazione. Poichè l'ultimo accade, i microbodies ACE2 non possono più impedire l'entrata virale.

ACE2 Microbody blocca la variante di D614G

Una variante di SARS-CoV-2 che contiene una mutazione puntiforme di D614G nella proteina di S è conosciuta per trasformarsi nella variante dominante dovunque emerga rapido. È associata con infettività aumentata. Lo pseudovirus di DS che contiene questa mutazione egualmente è bloccato moderatamente da ACE2 solubile, mentre sia il wildtype che il mutante ACE2 microbody sono più potenti alla replicazione virale d'inibizione con questa variante.  Un confronto dei due tipi di pseudoviruses riguardo all'associazione ha indicato che ACE2 solubile lega più efficientemente la variante ditrasporto di D614G, mentre

Le legature di ACE2 Microbody all'altro Betacoronavirus chiodano le proteine

Le proteine microbody di H345A e di ACE2 hanno impedito l'entrata di tutti gli pseudoviruses che portano le proteine differenti della punta di betacoronavirus, indicante un vasto spettro di anti--betacoronavirus mentre ACE2 solubile ha avuto attività antivirale più bassa.

Implicazioni

Il ACE2 microbody è di 10 volte più attivo che ACE2 solubile contro SARS-CoV-2 ed ha un'affinità quadruplo alle particelle virali. La sua origine umana significa che la sua immunizzazione è bassa. Egualmente sembra avere vasta efficacia contro le varianti emergenti della punta, compreso la mutazione di D614G.

I ricercatori hanno introdotto una mutazione specifica nel ACE2 microbody per eliminare l'attività catalitica dell'enzima mentre conservavano la sua attività antivirale. Questa mutazione è sembrato aumentare l'attività del potenziale di inibizione suo non ma microbody nell'analisi in tensione del virus.

I ricercatori egualmente suggeriscono che il microbody possa avere attività antivirale più significativa di quanto osservata qui perché la maggior parte degli esperimenti sono stati effettuati sulle celle che esprimono gli alti livelli di ACE2. Una volta analizzato su una linea cellulare con i livelli molto bassi ACE2, il ACE2 microbody ha avuto attività più antivirale.

I ricercatori riassumono, “l'entrata impedita proteina microbody bisolfuro-tenuta da adesivo ACE2 SARS-CoV-2 del virus pseudotyped proteina lentiviral della punta e SARS-CoV-2 in tensione con una sostanza solubile invariata superiore ACE2 di potenza 10 volte ed erano attivi dopo il virus iniziale che lega alla cella.„

Lo studio egualmente indica che la proteina di D614G S conferisce più alta infettività e un'più alta affinità per ACE2. Tuttavia, il ACE2 microbody poteva neutralizzare lo pseudovirus che contengono questa variante della punta come pure altre proteine della punta di betacoronavirus. Ciò potrebbe indicare che questa tecnologia può essere usata per neutralizzare i coronaviruses recentemente emergenti che legano al ricevitore ACE2 pure, permettendo al suo uso come “reagente disponibile immediatamente che potrebbe essere spiegato rapido.'

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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