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ACE2 entrada microbody solúvel dos blocos SARS-CoV-2 em pilhas do pulmão

Porque a pandemia COVID-19 continua a espalhar em muitas partes do mundo, há uma necessidade urgente para uma vacina preventiva e uma terapêutica melhorada. Um estudo novo por pesquisadores no centro médico de NYU Langone e na faculdade médica de Weill Cornell e publicado no bioRxiv* do server da pré-impressão relata em setembro de 2020 o potencial de uma enzima deconversão 2 (ACE2) - complexo de Fc do anticorpo em um formato novo que pareça oferecer uma inibição mais significativa de SARS-CoV-2.

ACE2 foi um dos alvos de revelação terapêutica e vacinal principais devido a seu papel intrínseco no acessório viral através da glicoproteína do ponto e a entrada na pilha de anfitrião. Obstruir esta primeira etapa poderia impedir a infecção completamente, e é uma intervenção fácil devido ao lugar do alvo na superfície da pilha, que evita a necessidade para a entrada da pilha.

Receptors ACE2 solúveis

A pesquisa adiantada examinou o uso dos receptors solúveis para HIV-1, desde que o emperramento viral aos receptors CD4 através da glicoproteína gp120competitively do envelope inibe seu acessório ao receptor de célula T do alvo CD4, impede desse modo a entrada viral. In vitro os estudos confirmaram este mecanismo da inibição viral.

Quando a proteína foi fundida à parcela de Fc de uma molécula da imunoglobulina, para formar um immunoadhesin, os dímero gp120 foram formados, com avidez significativamente aumentada. Isto foi mostrado, in vivo, para conduzir a uma duração mais longa da sobrevivência da proteína no corpo.

o Selvagem-tipo e as proteínas microbody de H345A ACE2 são dímero ligados bissulfeto. (a) Os domínios de ACE2 são mostrados com as estruturas do ACE2 solúvel (sACE2), de ACE2 microbody e proteínas microbody de ACE2.H345A abaixo. As proteínas ACE2 solúveis são suprimidas para a transmembrana e os domínios citoplasmáticas. As proteínas ACE2 microbody são fundidas ao domínio humano cada um de IgG CH3 com um 8XHis-tag carboxyterminal. IC: domínio intracelular.
o Selvagem-tipo e as proteínas microbody de H345A ACE2 são dímero ligados bissulfeto. (a) Os domínios de ACE2 são mostrados com as estruturas do ACE2 solúvel (sACE2), de ACE2 microbody e proteínas microbody de ACE2.H345A abaixo. As proteínas ACE2 solúveis são suprimidas para a transmembrana (TM) e os domínios citoplasmáticas. As proteínas ACE2 microbody são fundidas ao domínio humano cada um de IgG CH3 com um 8XHis-tag carboxyterminal. IC: domínio intracelular.

Mais tarde, uma outra alteração foi feita, com a adição de um peptide viral do coreceptor CCR5-derived ao immunoadhesin de CD4-Ig. Isto provado ser um inibidor viral poderoso, protegendo contra a infecção nos modelos animais.

Os negócios de papel actuais com um receptor solúvel similar aproximam-se a obstruir a entrada SARS-CoV-2, com base na proteína humana de recombinação do solúvel ACE2 (hrsACE2) ou no hrsACE2-IgG, que têm o ACE2 limitado a Ig-Fc. Ambos têm sido mostrados mais cedo para impedir a infecção com SARS-CoV e SARS-CoV-2 em um modelo do rato.

Em ensaios clínicos da fase 1 e da fase 2, esta proteína mostrou a obstrução parcial da actividade viral mas foi removida rapidamente da circulação. A meia-vida melhorou in vivo com a adição da parcela de Fc. Contudo, isto levanta interesses a respeito das possibilidades da doença severa devido ao realce dependendo dos anticorpos devido à presença do Fc. O receptor de Fc ocorre naturalmente em pilhas imunes e é o local do acessório do anticorpo do anti-ponto, conduzindo à entrada viral aumentada nestas pilhas.

Proteína de ACE2 Microbody

Para impedir este, os pesquisadores actuais exploraram usando um ser humano solúvel ACE2 “microbody” em qual a molécula ACE2 é fundida à corrente pesada Fc de Ig através do ectodomain do anterior. O ectodomain preserva os resíduos do cysteine, permitindo que os dímero da proteína formem, com uma afinidade maior da ligação para o vírus, mesmo ao reduzir sua massa molecular. Os dímero ACE2 solúveis e os dímero ACE2 microbody são mantidos unidos por ligações do não-bissulfeto e de bissulfeto.

Os pesquisadores encontraram que este microbody não está ligado ao receptor de Fc na superfície da pilha imune e conseqüentemente, não causará ADE. A actividade antivirosa do microbody era dez vezes mais altamente do que aquela de ACE2 solúvel, embora ambos eram dímero. Igualmente teve uma afinidade mais alta para o emperramento do virion. Na cultura do tecido, persistiu por um tempo mais longo do que ACE2 solúvel.

Igualmente obstruiu a entrada do vírus sobre uma escala das linha celular, para a variação original do ponto e a variação dominante de D614G, assim como a outro em um painel de beta-coronavirus proteínas do ponto.

Impedindo a actividade ACE2 catalítica

Os pesquisadores encontraram isso introduzir uma mutação específica de H345A a fim impedir que o ACE2 solúvel exerça sua actividade enzimático catalítica não impactou sua afinidade para a proteína de S. Isto é necessário para impedir seus efeitos na pressão sanguínea.

Pseudovirus incorpora o DS com infectividade aumentada

Pseudoviruses que expressa um mutante do supressão da proteína do ponto que remove a seqüência putativo da retenção do ER que impede a migração da proteína de S à superfície da pilha teve 20 ou mais cronometra uns níveis mais altos de proteína de S do que aqueles que expressaram a proteína completo de S. O número de virions era similar, contudo. A razão para a eficiência aumentada do empacotamento do DS é provavelmente a perda de inibição da cauda citoplasmática do ER na incorporação de S no virion desde que ambos são expressados quase ingualmente na superfície da pilha.

Os pesquisadores igualmente encontraram que os pseudoviruses que expressam a proteína de S limitam especificamente às proteínas ACE2 microbody solúveis. Este emperramento foi inibido pelo soro humano convalescente com um titer alto do anticorpo. O mutante ACE2 microbody (wildtype e solúvel) limita aos virions mais eficientemente do que a proteína microbody do wildtype, mesmo que o ácido aminado transformado não esteja na superfície, que interage com a proteína do ponto.

ACE2 Microbody obstrui a infecção de SARS-CoV-2 Pseudovirus

Os investigador examinaram a capacidade do ACE2 solúvel e do ACE2 microbody para impedir a réplica do pseudovirus de SARS-CoV-2 DS, usando um marcador da tintura fluorescente. Encontraram que quando ACE2 solúvel teve a actividade antivirosa moderado, o microbody era muito mais poderoso, quando o microbody transformado teve a actividade inibitório altamente poderoso. A concentração antivirosa eficaz EC50 era 1,24 μg/ml, 0,36 μg/ml e 0,15 μg/ml para o ACE2 solúvel, o ACE2 microbody e o ACE2 transformado microbody, respectivamente.

A actividade do ACE2 solúvel é similar àquela do soro convalescente e inibe explicitamente a proteína do ponto SARS-CoV-2.

Contaminaram uma linha celular com o SARS-CoV-2 projetado vivo que contem um gene do marcador da tintura fluorescente em ORF7 de modo que sua réplica pudesse ser monitorada. Encontraram que nas diluições de série, a actividade ACE2 antivirosa retida microbody do μg 1-0.125. Com ACE2 solúvel, com um EC50 de 1 μg, a actividade foi perdida em 0,5 μg. Selvagem-tipo e ACE2 transformado EC50 similar aqui mostrado microbody, sendo superior a ACE2 solúvel.

Determinaram então que as proteínas microbody seriam activas quando expor ao vírus em uns pontos mais atrasados do tempo também, com o anterior que está sendo adicionado simultaneamente ou até 6 horas após a infecção. Isto conduziu à inibição de 80% quando ambos estiveram adicionados simultaneamente, quase o mesmos em 30 minutos da infecção e 55% em 2 horas em que aproximadamente 10% do vírus infeccioso é limitado à pilha. A actividade enfraqueceu em seguida aquela.

Assim, o ACE2 microbody pode obstruir a infecção se actual antes do vírus que liga à pilha de alvo, ou na altura da exposição, e mesmo das até 2 horas que seguem a exposição. Este indicador do tempo indica o período em que o vírus não limitou ainda significativamente à pilha.

Além disso, mesmo logo depois que o vírus foi limitado, as taxas de infecção poderiam ser abaixadas incubando com o ACE2 microbody para os próximos 30 minutos. A taxa de vírus que liga ao receptor ACE2 foi encontrada para ser tempo-dependente, com muito mais emperramento em 4 horas comparadas a 1 hora da incubação, talvez porque somente algumas interacções spike-ACE2 ocorrem no início, seguido pelas proteínas adicionais de S que participam no emperramento ao longo do tempo. Porque o último ocorre, os microbodies ACE2 podem já não inibir a entrada viral.

ACE2 Microbody obstrui a variação de D614G

Uma variação de SARS-CoV-2 que contem uma mutação de ponto de D614G na proteína de S é sabida para transformar-se a variação dominante onde quer que emerge ràpida. É associada com a infectividade aumentada. O pseudovirus do DS que contem esta mutação está obstruído igualmente moderada por ACE2 solúvel, quando o wildtype e o mutante ACE2 microbody forem mais poderosos em inibir a réplica viral com esta variação.  Uma comparação dos dois tipos de pseudoviruses a respeito da ligação mostrada que ACE2 solúvel liga a variação ponto-levando de D614G mais eficientemente, quando

Ligamentos de ACE2 Microbody a outras proteínas do ponto de Betacoronavirus

As proteínas microbody de ACE2 e de H345A impediram a entrada de todos os pseudoviruses que levam proteínas diferentes do ponto do betacoronavirus, indicando um espectro largo de anti-betacoronavirus quando ACE2 solúvel teve uma mais baixa actividade antivirosa.

Implicações

O ACE2 microbody é 10 vezes mais activo do que ACE2 solúvel contra SARS-CoV-2 e tem uma afinidade da quatro-dobra às partículas virais. Sua origem humana significa que sua imunogenicidade é baixa. Igualmente parece ter a eficácia larga contra as variações emergentes do ponto, incluindo a mutação de D614G.

Os pesquisadores introduziram uma mutação específica no ACE2 microbody para eliminar a actividade catalítica da enzima ao preservar sua actividade antivirosa. Esta mutação pareceu aumentar a actividade de potencial microbody mas não seu da inibição no ensaio vivo do vírus.

Os pesquisadores igualmente sugerem que o microbody possa ter uma actividade antivirosa mais significativa do que observada aqui porque a maioria das experiências foram realizadas nas pilhas que expressam níveis elevados de ACE2. Quando analisado em uma linha celular com níveis ACE2 muito baixos, o ACE2 microbody teve uma actividade mais antivirosa.

Os investigador resumem, “proteína microbody bissulfeto-ligada a entrada ACE2 inibida SARS-CoV-2 do vírus pseudotyped do ponto proteína lentiviral e SARS-CoV-2 vivo com um solúvel do que unmodified mais alto ACE2 da potência 10 vezes e eram activos após o vírus inicial que liga à pilha.”

O estudo igualmente mostra que a proteína de D614G S confere uma infectividade mais alta e uma afinidade mais alta para ACE2. Contudo, o ACE2 microbody podia neutralizar o pseudovirus que contêm esta variação do ponto, assim como outras proteínas do ponto do betacoronavirus. Isto poderia indicar que esta tecnologia pode ser usada para neutralizar os coronaviruses recentemente emergentes que ligam ao receptor ACE2 também, permitindo seu uso como “um reagente disponível imediatamente que poderia ràpida ser distribuído.'

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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