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ACE2 asiento microbody soluble de las cuadras SARS-CoV-2 en las células del pulmón

A medida que el pandémico COVID-19 continúa extenderse en muchas partes del mundo, hay una necesidad urgente de una vacuna preventiva y de una terapéutica perfeccionada. Un nuevo estudio de los investigadores en el centro médico de NYU Langone y la universidad médica de Weill Cornell y publicado en el bioRxiv* del servidor de la prueba preliminar denuncia en septiembre de 2020 el potencial de una enzima angiotensina-que convierte 2 (ACE2) - complejo de Fc del anticuerpo en un nuevo formato que parezca ofrecer una inhibición más importante de SARS-CoV-2.

ACE2 ha sido uno de los objetivos de desarrollo terapéutico y vaccíneo primeros debido a su papel intrínseco en la agregación viral vía la glicoproteína del pico y asiento en la célula huesped. Cegar este primer paso podría prevenir la infección en conjunto, y es una intervención fácil debido a la situación del objetivo en la superficie de la célula, que evita la necesidad del asiento de la célula.

Receptores solubles ACE2

La investigación temprana examinó el uso de los receptores solubles para HIV-1, puesto que el atascamiento viral a los receptores CD4 vía la glicoproteína gp120competitively del envolvente inhibe su agregación al receptor del linfocito T del objetivo CD4, de tal modo previene el asiento viral. Los estudios ines vitro confirmaron este mecanismo de la inhibición viral.

Cuando la proteína fue fundida a la porción de Fc de una molécula de la inmunoglobulina, para formar un immunoadhesin, los dimeros gp120 fueron formados, con avidez importante creciente. Esto fue mostrada, in vivo, para dar lugar a una duración más larga de la supervivencia de la proteína en la carrocería.

el Salvaje-tipo y las proteínas microbody de H345A ACE2 son dimeros pegados disulfuro. (a) Los dominios de ACE2 se muestran con las estructuras del ACE2 soluble (sACE2), de ACE2 microbody y las proteínas microbody de ACE2.H345A abajo. Las proteínas solubles ACE2 se suprimen para la transmembrana y los dominios citoplásmicos. Las proteínas microbody ACE2 se funden al dominio humano cada uno de IgG CH3 con un 8XHis-tag carboxitrminal. IC: dominio intracelular.
el Salvaje-tipo y las proteínas microbody de H345A ACE2 son dimeros pegados disulfuro. (a) Los dominios de ACE2 se muestran con las estructuras del ACE2 soluble (sACE2), de ACE2 microbody y las proteínas microbody de ACE2.H345A abajo. Las proteínas solubles ACE2 se suprimen para la transmembrana (TM) y los dominios citoplásmicos. Las proteínas microbody ACE2 se funden al dominio humano cada uno de IgG CH3 con un 8XHis-tag carboxitrminal. IC: dominio intracelular.

Más adelante, otra modificación fue hecha, con la adición de un péptido viral del coreceptor CCR5-derived al immunoadhesin de CD4-Ig. Esto demostrada ser un inhibidor viral potente, protegiendo contra la infección en los modelos animales.

Los tratos de papel actuales con un receptor soluble similar se acercan a cegar el asiento SARS-CoV-2, sobre la base de la proteína humana recombinante de la solubilidad ACE2 (hrsACE2) o de hrsACE2-IgG, que tienen el ACE2 limitado a Ig-Fc. Ambos se han mostrado anterior para prevenir la infección con los SARS-CoV y SARS-CoV-2 en un modelo del ratón.

En juicios clínicas de la fase 1 y de la fase 2, esta proteína mostró cegar parcial de la actividad viral pero fue quitada rápidamente de la circulación. La semivida perfeccionó in vivo con la adición de la porción de Fc. Sin embargo, esto despierta inquietudes en cuanto a las ocasiones de la enfermedad severa debido al aumento con dependencia de los anticuerpos debido a la presencia del Fc. El receptor de Fc ocurre naturalmente en las células inmunes y es el sitio de la agregación del anticuerpo del anti-pico, llevando al asiento viral creciente en estas células.

Proteína de ACE2 Microbody

Para prevenir esto, los investigadores actuales explorados usando un ser humano soluble ACE2 “microbody” en cuál se funde la molécula ACE2 a la cadena pesada Fc de Ig a través del ectodomain del anterior. El ectodomain preserva los residuos de la cisteína, permitiendo que los dimeros de la proteína formen, con una mayor afinidad de atar para el virus, incluso mientras que reduce su Massachusetts molecular. Los dimeros solubles ACE2 y los dimeros microbody ACE2 son ligados por las ligazones del no-disulfuro y de disulfuro.

Los investigadores encontraron que este microbody no podida para atar al receptor de Fc en la superficie de la célula inmune y por lo tanto, no dará lugar a ADE. La actividad antivirus del microbody era diez veces más arriba que el de ACE2 soluble, aunque ambos eran dimeros. También tenía una afinidad más alta para el atascamiento del virion. En cultura del tejido, persistió por un tiempo más largo que ACE2 soluble.

También cegó el asiento del virus sobre un alcance de variedades de células, para la variante original del pico y la variante dominante de D614G, así como otros en un panel de las proteínas beta-coronavirus del pico.

Prevención de la actividad catalítica ACE2

Los investigadores encontraron eso la introducción de una mutación específica de H345A para evitar que el ACE2 soluble ejerza su actividad enzimática catalítica no afectó su afinidad para la proteína de S. Esto es necesario prevenir sus efectos sobre la presión arterial.

Pseudovirus incorpora el DS con contagiosidad creciente

Pseudoviruses que expresaba un mutante de la supresión de la proteína del pico que quita la serie supuesta de la retención del ER que previene la migración de la proteína de S a la superficie de la célula tenía 20 o más cronometra niveles más altos de proteína de S que los que expresaron la proteína integral de S. El número de virions era similar, sin embargo. La razón de la eficiencia creciente del empaquetado del DS es probablemente la baja de la inhibición de la cola citoplásmica del ER en la incorporación de S en el virion puesto que ambos se expresan casi igualmente en la superficie de la célula.

Los investigadores también encontraron que los pseudoviruses que expresan la proteína de S limitan específicamente a las proteínas microbody solubles ACE2. Este atascamiento fue inhibido por el suero humano convaleciente con un alto título del anticuerpo. El mutante ACE2 microbody (wildtype y solubilidad) limita a los virions más eficientemente que la proteína microbody del wildtype, aunque el aminoácido transformado no está en la superficie, que obra recíprocamente con la proteína del pico.

ACE2 Microbody ciega la infección de SARS-CoV-2 Pseudovirus

Los investigadores examinaron la capacidad del ACE2 soluble y del ACE2 microbody de prevenir la réplica del pseudovirus de SARS-CoV-2 DS, usando un marcador del tinte fluorescente. Encontraron que mientras que ACE2 soluble tenía actividad antivirus moderada, el microbody era mucho más potente, mientras que el microbody transformado tenía actividad inhibitoria altamente potente. La concentración antivirus efectiva EC50 era 1,24 μg/ml, 0,36 μg/ml y 0,15 μg/ml para el ACE2 soluble, el ACE2 microbody y el ACE2 transformado microbody, respectivamente.

La actividad del ACE2 soluble es similar a la del suero convaleciente e inhibe explícitamente la proteína del pico SARS-CoV-2.

Infectaron una variedad de células con SARS-CoV-2 dirigido vivo que contenía un gen del marcador del tinte fluorescente en ORF7 de modo que su réplica pudiera ser vigilada. Encontraron que en las diluciones seriales, la actividad antivirus conservada microbody ACE2 a partir del μg el 1-0.125. Con ACE2 soluble, con un EC50 de 1 μg, la actividad fue perdida en 0,5 μg. Salvaje-tipo y ACE2 transformado EC50 similar aquí mostrado microbody, siendo superior a ACE2 soluble.

Entonces determinaron que las proteínas microbody serían activas cuando estaban expuestas al virus en puntos posteriores del tiempo también, con el anterior que es agregado simultáneamente o hasta 6 horas después de la infección. Esto dio lugar a la inhibición del 80% cuando ambos simultáneamente, casi fueron agregados lo mismo en 30 minutos de la infección y el 55% en 2 horas en que el cerca de 10% del virus infeccioso está limitado a la célula. La actividad disminuyó después eso.

Así, el ACE2 microbody puede cegar la infección si es presente antes del virus que ata a la célula de objetivo, o a la hora de la exposición, e incluso de hasta 2 horas que siguen la exposición. Esta ventana del tiempo indica el período en el cual el virus no ha limitado todavía importante a la célula.

Por otra parte, incluso pronto después de que el virus estuviera limitado, los índices de infección podrían ser bajados incubando con el ACE2 microbody para los 30 minutos próximos. El índice de virus que ataba al receptor ACE2 fue encontrado para ser dependiente del tiempo, con mucho más atascamiento en 4 horas comparadas a 1 hora de incubación, quizás porque solamente ocurren algunas acciones recíprocas spike-ACE2 al principio, seguido por las proteínas adicionales de S que entraban en el atascamiento en un cierto plazo. Pues ocurre este último, los microbodies ACE2 pueden no más inhibir el asiento viral.

ACE2 Microbody ciega variante de D614G

Una variante de SARS-CoV-2 que contiene una mutación de punto de D614G en la proteína de S se sabe para convertirse en la variante dominante dondequiera que emerja rápidamente. Se asocia a contagiosidad creciente. El pseudovirus del DS que contiene esta mutación también es cegado moderado por ACE2 soluble, mientras que el wildtype y el mutante ACE2 microbody son más potentes en la inhibición de la réplica viral con esta variante.  Una comparación de los dos tipos de pseudoviruses referentes a atar mostrado que ACE2 soluble ata la variante pico-que lleva de D614G más eficientemente, mientras que

Lazos de ACE2 Microbody a otras proteínas del pico de Betacoronavirus

Las proteínas microbody de ACE2 y de H345A previnieron el asiento de todos los pseudoviruses que llevaban diversas proteínas del pico del betacoronavirus, indicando un espectro amplio de anti-betacoronavirus mientras que ACE2 soluble tenía actividad antivirus más inferior.

Implicaciones

El ACE2 microbody es más activo de diez veces que ACE2 soluble contra SARS-CoV-2 y tiene una afinidad cuádruple a las partículas virales. Su origen humano significa que su inmunogeneticidad es inferior. También aparece tener eficacia amplia contra variantes emergentes del pico, incluyendo la mutación de D614G.

Los investigadores introdujeron una mutación específica en el ACE2 microbody para eliminar la actividad catalítica de la enzima mientras que preservaban su actividad antivirus. Esta mutación aparecía aumentar la actividad potencial microbody pero del no su de la inhibición en el análisis vivo del virus.

Los investigadores también sugieren que el microbody pueda tener actividad antivirus más importante que observada aquí porque la mayor parte de los experimentos fueron realizados en las células que expresan niveles de ACE2. Cuando estaba ensayado en una variedad de células con los niveles muy inferiores ACE2, el ACE2 microbody tenía actividad más antivirus.

Los investigadores resumen, “el asiento inhibido proteína microbody disulfuro-bajo fianza ACE2 SARS-CoV-2 del virus pseudotyped proteína lentiviral del pico y SARS-CoV-2 vivo con una solubilidad que sin modificar más alta ACE2 de la potencia diez veces y eran activos después del virus inicial que ata a la célula.”

El estudio también muestra que consulta la proteína de D614G S una contagiosidad más alta y una afinidad más alta para ACE2. Sin embargo, el ACE2 microbody podía neutralizar el pseudovirus que contenía esta variante del pico, así como otras proteínas del pico del betacoronavirus. Esto podría indicar que esta tecnología se puede utilizar para neutralizar los coronaviruses nuevamente emergentes que atan al receptor ACE2 también, habilitando su uso como “reactivo disponible que se podría desplegar rápidamente.'

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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