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Un vaccino dell'sottounità SARS-CoV-2 può offrire la più vasta protezione contro il virus

In un anno dell'inizio della pandemia COVID-19, gli scienziati hanno scoperto che è molto più complessa di quanto preveduta. Con oltre 31 milione casi e quasi milione infortuni mortali, il risultato di immunità del gregge è ancora lontano. Nel frattempo, i centinaia di gruppi di ricerca stanno lavorando per trovare un vaccino il più rapidamente possibile, messo a fuoco principalmente sulla proteina virale della punta facendo uso di molte strategie differenti.

Un nuovo studio dai ricercatori ai Biopharmaceuticals del trifoglio ed all'istituto di Tsinghua di ricerca biomedica pluridisciplinare, l'università Tsinghua e pubblicato nel bioRxiv* del " server " della pubblicazione preliminare nel settembre 2020 riferisce sulla struttura di questa proteina, come rivelatore da microscopia dell'cryo-elettrone (cryoEM).

Criteri vaccino

Affinchè tutto il vaccino riescano, quattro criteri devono essere soddisfatti. Vale a dire, deve essere sicuro, efficace, evolutivo e deve essere diventato velocemente. I vaccini dell'sottounità della proteina incontrano i primi tre, come dimostrato dal papillomavirus umano (HPV) Gardasil vaccino e dal vaccino Shingrix di herpes zoster. Eppure, richiedono tempo molto molto essere prodotto, imbattendosi nelle decadi.

Una grande ragione è la difficoltà di assicurazione che l'antigene dell'sottounità della proteina conserva la sua struttura molto vicino al modulo indigeno in tutto il processo di fabbricazione. Nel caso del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo, la proteina della punta è un antigene di superficie trimeric che è essenziale per l'entrata virale nella cellula ospite. La sfida qui è di stabilizzare questo nella conformazione trimeric mentre però introducendo una mutazione nell'antigene virale in modo che ` si congeli' nello stato di prefusion. Il primo è usando un trimero-foldon non covalente dalla proteina batterica del fago GCN4. Il secondo è solitamente impedendo la fenditura della punta con una mutazione al sito di fenditura di furin.

Flusso di lavoro dell
Flusso di lavoro dell'elaborazione dei dati Cryo-EM per il S-Trimero della TA.

Tecnologia del Trimero-Tag

Sebbene queste tecniche siano state usate durante le decadi della ricerca sui vaccini di RSV e del HIV, è considerevole che entrambi ancora non hanno reso un singolo riuscito vaccino. La ricerca corrente, quindi, ha usato un altro itinerario, vale a dire, il Trimero-Tag, per produrre sia selvaggio tipo solubile (WT) che i moduli mutanti di un sito (MT) di furin del S-Trimero in un bioreattore con i grandi rendimenti di 0.5-1 g/l.

Ciò eccede precedentemente ha riferito i rendimenti dell'antigene da tre ordini di grandezza riguardo alle proteine di S derivate foldon con una doppio Pro mutazione, così provando la sua scalabilità.

La struttura di CryoEM del S-trimero mostra un ectodomain da residuo 1-1211, fuso alla regione del C-terminale di collagene di tipo I umano per formare un homotrimer via i legami bisolfurico. I ricercatori hanno usato una proteina di fusione del ricevitore del collageno di alto-affinità per legare al Trimero-Tag in una depurazione di affinità installata in modo che i S-trimeri secernuti fossero depurati quasi in modo omogeneo ad un punto.

Più alta infettività dovuto fenditura di Furin

L'analisi di questa proteina rivela una proteina metastabile del PESO S nel modulo trimeric, parzialmente fenduto fra lo S1 e S2. Quando la mutazione unica è stata introdotta nel trimero della TA S, la proteina è rimanere intatta. Interessante, la proteina di SAR-CoV S del PESO egualmente uncleaved dalla proteasi di furin.

Tutte e tre le varianti della punta discusse finora hanno una simile alta affinità a ACE2-Fc a concentrazione nanomolar. I ricercatori commentano che questo indica che “l'infettività molto più alta di SARS-CoV-2 è più probabile attribuita a fenditura di furin della proteina della punta che è in gran parte assente in quanto di SARS-CoV-1,„ piuttosto che essendo dovuto la differenza nelle loro rispettive affinità al ricevitore.

Struttura strettamente chiusa

Sia i trimeri della TA che del PESO S sono rivelati per essere particelle omogenee nell'ambito di microscopia elettronica di macchiatura negativa. La struttura interna era chiara ed hanno osservato che il Trimero-Tag non è stato veduto nella struttura molecolare a causa della flessibilità del linker. Il linker è la sequenza che unisce la S solubile al C-prodomain della molecola del collageno.

Egualmente hanno trovato che i domini di RBD in tutti e tre i protomers erano giù nella conformazione, a differenza di quello della proteina precedentemente osservata di S con una doppio Pro mutazione. Sull'allineamento dei domini S2, hanno trovato che tutti e tre i domini S1 si sono spostati verso l'asse triplo riguardante la loro posizione nella struttura di S-2P. Ciò piombo ad una struttura strettamente chiusa.

Le interazioni acide di PS80/Fatty stabilizzano lo stato chiuso

D'altra parte, c'era densità inattesa sia nel dominio del N-terminale che nel RBD del dominio S1. Il precedente era probabilmente dovuto la presenza del detersivo PS80, sepolta in profondità nei residui idrofobi della casella mentre alcuni residui idrofili della proteina della punta formano i legami idrogeni con il gruppo di idrossile PS80.

La natura prolungata della densità di EM nel RBD ha suggerito che potesse essere dovuto acido oleico o linoleico nel terreno di coltura. Il EM di alta qualità che mappa la funzionalità permette che entrambo acido delle molecole (P80 e l'oleico o linoleico) sia inserito bene nella densità di questi domini e la loro identità è stata confermata dall'analisi di spettrometria di massa. Quindi, PS80 probabilmente presta la stabilità e l'ordine ai cicli disordinati di NTD.

L'acido oleico nella casella idrofoba del RBD è limitato tramite ponte di sale al protomer adiacente, di modo che entrambi i domini di RBD vengono l'un l'altro nella grande prossimità, rappresentante la conformazione chiusa.

Le circostanze acide favoriscono lo stato chiuso

Il trimero di S è stabile nelle circostanze acide, come confermato da un aspetto più omogeneo di queste particelle ad un pH di 5,5 confrontati al pH fisiologico. Tuttavia, a questo pH, il NTD pure non è stato veduto in TA S come nel trimero del PESO S.

I ricercatori hanno osservato un elemento dell'opzione, che hanno chiamato opzione 2 di pH, nel C-terminale domain-1. Nella struttura della TA, questo ha subito la riorganizzazione strutturale dipendente dal pH. Ad un pH acido, forma una struttura di ripetizione elicoidale, mentre era disordinato a pH fisiologico.

È pensato che questo sia perché la protonazione si presenta ad a basso pH. Ciò provoca le interazioni idrofobe invece della disposizione disordinata più iniziale, con una disposizione di ripetizione ordinata.

Questo motivo strutturale contatta l'opzione 1 di pH del protomer vicino e stabilizza il trimero in uno stato strettamente chiuso, in cui tutti e tre le RBDs sono l'un l'altro egualmente nella grande prossimità. Questa osservazione è supportata dagli studi più iniziali ed indica che il cambiamento nella conformazione della TA contro la proteina trimeric del PESO S è avviato dal cambiamento nel pH piuttosto che la mutazione di fenditura di furin.

I favori di D614G aprono la conformazione di RBD

In generale, quindi, i ricercatori hanno trovato tre stati della proteina di S. Ciò comprende uno stato strettamente chiuso, uno stato senza bloccare chiuso e uno stato aperto, con l'opzione dal prima - lo stato terzo tramite opzione di pH o conformazionale, anche chiamata il fusione-peptide regione prossimale (FPPR), che altamente è ordinata.

È stato osservato che la mutazione di D614G diventa dominante dappertutto emerge dovuto la sua infettività aumentata. Il D614 è responsabile di formazione di ponte del sale che comprende un residuo nella conformazione strettamente chiusa di RBD alla regione dell'opzione. Affinchè questo si apra, deve subire un profondo cambiamento ad una disposizione disordinata.

Quando la mutazione di D614G accade, questo ponte di sale più non è formato. Il cambiamento causa lanciare del residuo che precedentemente ha interagito con il ponte di sale in modo che nella sua nuova posizione, interagisca con altri residui sul CTD1. Il risultato è uno spostamento discendente dello S1 riguardante lo S2. Il movimento discendente definitivo del dominio CTD1 provoca la conformazione aperta del RBD che permette che leghi al ricevitore della cellula ospite ACE2.

Implicazioni

I ricercatori in questo studio hanno usato il Trimero-Tag per generare sia le varianti (WT) trimeric mutanti di furin che (MT) selvaggio tipe del sito della punta della proteina. Hanno esaminato entrambe le strutture della proteina con cryoEM. Hanno trovato che entrambi sono in una conformazione strettamente chiusa, ma sono strutturalmente quasi identiche alla proteina integrale della punta del PESO una volta visualizzate in una soluzione contenente detersivo.

I ricercatori precisano che questa è la prima volta una struttura cryo-EM è stata descritta per la proteina del trimero del PESO S nel modulo metastabile solubile. L'integrità strutturale della proteina descritta tiene conto i candidati vaccino essere sviluppata in base alla proteina del trimero della punta del PESO piuttosto che, come precedentemente, alla mutazione di fenditura di furin variabile o alla variante di S-2P.

Ciò dovrebbe essere associata con la più vasta protezione e la maggior efficacia vaccino. I ricercatori dicono, “la tecnologia del Trimero-Tag che si è rivelata qui potere produrre rapido un gran quantità di antigene del tipo di indigena del S-Trimero, possono offrire una tecnologia della piattaforma per sviluppo del vaccino dell'sottounità per i virus a RNA avvolti che usano gli antigeni trimeric onnipresenti per invadere le cellule ospiti.„

I ricercatori dicono che non sono sicuri se il sito di fenditura di furin in questa struttura è fenduto o intatto, non potrebbero essi eliminare altri stati conformazionali nel campione del PESO. Malgrado questo, dicono che il trimero depurativo del PESO S è principalmente in uno stato di prefusion, mentre la proteina integrale della punta del PESO è trovata per adottare sia gli stati di post-fusione che pre- in presenza del detersivo.

La manifestazione preclinica di studi questo candidato vaccino può indurre rapido gli alti livelli degli anticorpi di neutralizzazione, con una risposta immunitaria cellulare utile di Th1-skewed in roditori ed in primati non umani. L'ultimo era egualmente completamente protetto dall'infezione SARS-CoV-2 dopo immunizzazione. Un tal vaccino dell'sottounità ora sta analizzando nei test clinici.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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