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Uma vacina da subunidade SARS-CoV-2 pode oferecer uma protecção mais larga contra o vírus

Dentro de um ano do começo da pandemia COVID-19, os cientistas descobriram que é distante mais complexa do que esperada. Com sobre 31 milhão casos e quase milhão fatalidades, a realização da imunidade do rebanho está ainda longe. Entrementes, as centenas de equipas de investigação estão trabalhando para encontrar o mais rápido possível uma vacina, focalizado principalmente na proteína viral do ponto usando muitas estratégias diferentes.

Um estudo novo por pesquisadores em Biopharmaceuticals do trevo e em instituto de Tsinghua da pesquisa biomedicável multidisciplinar, a universidade de Tsinghua e publicado no bioRxiv* do server da pré-impressão relata em setembro de 2020 na estrutura desta proteína, como revelado pela microscopia do cryo-elétron (cryoEM).

Critérios vacinais

Para que toda a vacina seja bem sucedida, quatro critérios devem ser encontrados. A saber, deve ser segura, eficaz, evolutiva, e deve ser tornada rapidamente. As vacinas da subunidade da proteína encontram os primeiros três, como demonstrado pelo papillomavirus humano (HPV) Gardasil vacinal e pela vacina Shingrix do zoster de herpes. Ainda, tomam muito uns muitos tempos ser produzido, sendo executado em décadas.

Uma razão grande é a dificuldade de assegurar-se de que o antígeno da subunidade da proteína retenha sua estrutura muito perto ao formulário nativo durante todo o processo de manufactura. No caso do coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), a proteína do ponto é um antígeno de superfície trimeric que seja essencial para a entrada viral na pilha de anfitrião. O desafio aqui é estabilizar isto na conformação trimeric ao igualmente introduzir uma mutação no antígeno viral de modo que ` se congele' no estado do prefusion. O primeiro é usando um trimer-foldon não-covalent da proteína bacteriana do fago GCN4. O segundo é geralmente impedindo a segmentação do ponto com uma mutação no local da segmentação do furin.

Trabalhos Cryo-EM de processo de dados para o S-Trimer da TA.
Trabalhos Cryo-EM de processo de dados para o S-Trimer da TA.

Tecnologia da Trimer-Etiqueta

Embora estas técnicas foram usadas sobre décadas da pesquisa sobre vacinas do VIH e do RSV, é notável que ambos não renderam ainda uma única vacina bem sucedida. A pesquisa actual, usou conseqüentemente uma outra rota, a saber, uma Trimer-Etiqueta, para produzir formulários do selvagem-tipo (WT) solúvel e de um mutante do local (MT) do furin do S-Trimer em um bioreactor com grandes rendimentos de 0.5-1 g/l.

Isto excede relatou previamente rendimentos do antígeno por três ordens de grandeza a respeito das proteínas derivadas foldon de S com uma dobro-Pro mutação, assim provando sua escalabilidade.

A estrutura de CryoEM do S-trimer mostra um ectodomain do resíduo 1-1211, fundido à região do C-terminal de tipo humano me colagénio para formar um homotrimer através das ligações de bissulfeto. Os pesquisadores usaram uma proteína da fusão do receptor do colagénio da alto-afinidade para ligar à Trimer-Etiqueta em uma purificação da afinidade estabelecida de modo que os S-trimers segregados fossem refinados quase homogênea em uma etapa.

Infectividade mais alta devido à segmentação de Furin

A análise desta proteína revela uma proteína metastable do PESO S no formulário trimeric, fendido parcialmente entre o S1 e o S2. Quando a única mutação de ponto foi introduzida no trimer da TA S, a proteína permaneceu intacto. Interessante, a proteína de SARS-CoV S do PESO igualmente uncleaved pelo protease do furin.

Todas as três variações do ponto discutidas até agora têm uma afinidade alta similar a ACE2-Fc na concentração nanomolar. Os pesquisadores comentam que este mostra que “a infectividade muito mais alta de SARS-CoV-2 é mais provável atribuída à segmentação do furin da proteína do ponto que é pela maior parte ausente naquela de SARS-CoV-1,” um pouco do que sendo devido à diferença em suas afinidaoes respectivas ao receptor.

Estrutura firmemente fechado

Os trimers do PESO e da TA S são revelados para ser partículas homogêneas sob a microscopia de elétron de mancha negativa. A estrutura interna era clara, e observaram que a Trimer-Etiqueta não estêve vista na estrutura molecular devido à flexibilidade do linker. O linker é a seqüência que se junta ao S solúvel ao C-prodomain da molécula do colagénio.

Igualmente encontraram que os domínios de RBD em todos os três protomers estavam para baixo na conformação, ao contrário daquele da proteína previamente observada de S com uma dobro-Pro mutação. No alinhamento dos domínios S2, encontraram que todos os três domínios S1 deslocaram para a linha central triplo relativo a sua posição na estrutura de S-2P. Isto conduziu a uma estrutura firmemente fechado.

As interacções ácidas de PS80/Fatty estabilizam o estado fechado

Por outro lado, havia uma densidade inesperada no domínio do N-terminal e no RBD do domínio S1. O anterior era provavelmente devido à presença do detergente PS80, enterrada profundamente nos resíduos hidrofóbicas do bolso quando alguns resíduos hidrófilos da proteína do ponto formarem ligações de hidrogênio com o grupo de hidróxilo PS80.

A natureza alongada da densidade do EM no RBD sugeriu que pudesse ser devido ao ácido oleic ou linoleic no media de cultura. O EM de alta qualidade que traça a característica permite que both of these ácido das moléculas (P80 e o oleic ou linoleic) seja cabido bem na densidade destes domínios, e sua identidade foi confirmada pela análise da espectrometria em massa. Assim, PS80 empresta provavelmente a estabilidade e o pedido aos laços desorganizado de NTD.

O ácido oleic no bolso hidrofóbica do RBD é limitado através de uma ponte de sal ao protomer adjacente, de modo que ambos os domínios de RBD venham na grande proximidade entre si, esclarecendo a conformação fechado.

As circunstâncias ácidas favorecem o estado fechado

O trimer de S é estável sob circunstâncias ácidas, como confirmado por uma aparência mais homogênea destas partículas em um pH de 5,5 comparados ao pH fisiológico. Contudo, neste pH, o NTD também não foi visto na TA S como no trimer do PESO S.

Os pesquisadores observaram um elemento do interruptor, que chamassem o interruptor 2 do pH, no C-terminal domain-1. Na estrutura da TA, isto submeteu-se ao rearranjo estrutural pH-dependente. Em um pH ácido, forma uma estrutura de repetição helicoidal, visto que era desorganizado no pH fisiológico.

Pensa-se que este é porque o protonation ocorre em um mais baixo pH. Isto conduz às interacções hidrofóbicas em vez do regime desordenado mais adiantado, com um regime de repetição pedido.

Este motivo estrutural vem em contacto com o interruptor 1 do pH do protomer vizinho e estabiliza o trimer em um estado firmemente fechado, onde todos os três RBDs estejam igualmente na grande proximidade entre si. Esta observação é apoiada por uns estudos mais adiantados e indica que a mudança na conformação da TA contra a proteína trimeric do PESO S está provocada pela mudança no pH um pouco do que a mutação da segmentação do furin.

Os favores de D614G abrem a conformação de RBD

Totais, conseqüentemente, os pesquisadores encontraram três estados da proteína de S. Isto inclui um estado firmemente fechado, um estado frouxamente fechado, e um estado aberto, com o interruptor do primeiro ao terceiro estado através do interruptor conformational ou do pH, igualmente chamado o fusão-peptide a região proximal (FPPR), que é pedida altamente.

Observou-se que a mutação de D614G se torna dominante em toda parte ele emerge devido a sua infectividade aumentada. O D614 é responsável para a formação de ponte de sal que envolve um resíduo na conformação firmemente fechado de RBD na região do interruptor. Para que isto abra, tem que submeter-se a uma mudança marcada a um regime desordenado.

Quando a mutação de D614G ocorre, esta ponte de sal está formada já não. A mudança causa um lançamento do resíduo que interagiu anteriormente com a ponte de sal de modo que em sua posição nova, interagisse com outros resíduos no CTD1. O resultado é uma SHIFT descendente do S1 relativo ao S2. O movimento descendente final do domínio CTD1 conduz à conformação aberta do RBD que permite que ligue ao receptor da pilha de anfitrião ACE2.

Implicações

Os pesquisadores neste estudo usaram a Trimer-Etiqueta para gerar o selvagem-tipo (WT) e as variações trimeric da proteína (MT) do ponto do mutante do local do furin. Examinaram ambas as estruturas da proteína com cryoEM. Encontraram que ambos estão em uma conformação firmemente fechado, mas estrutural são quase idênticos à proteína completo do ponto do PESO quando visualizados em uma solução decontenção.

Os pesquisadores indicam que esta é uma estrutura cryo-EM tem sido descrita a primeira vez para a proteína do trimer do PESO S no formulário metastable solúvel. A integridade estrutural da proteína descrita permite candidatos vacinais ser desenvolvida com base na proteína do trimer do ponto do PESO um pouco do que, como anteriormente, na mutação da segmentação do furin variante ou na variação de S-2P.

Isto deve ser associado com a protecção mais larga e a maior eficácia vacinal. Os pesquisadores dizem, da “a tecnologia Trimer-Etiqueta que foi provada aqui poder produzir ràpida grandes quantidades nativo-como de antígeno do S-Trimer, podem oferecer uma tecnologia da plataforma para a revelação vacinal da subunidade para os vírus envolvidos do RNA que usam antígenos trimeric ubíquos para invadir pilhas de anfitrião.”

Os pesquisadores dizem que não são certos se o local da segmentação do furin nesta estrutura é fendido ou intacto, não poderiam eles ordenam para fora outros estados conformational na amostra do PESO. Apesar disto, dizem que o trimer refinado do PESO S está na maior parte em um estado do prefusion, visto que a proteína completo do ponto do PESO é encontrada para adotar estados pre- e da cargo-fusão na presença do detergente.

A mostra pré-clínica dos estudos este candidato vacinal pode induzir ràpida níveis elevados de anticorpos de neutralização, com uma resposta imune celular benéfica de Th1-skewed nos roedores e em primatas não-humanos. O último foi protegido igualmente completamente da infecção SARS-CoV-2 após a imunização. Tal vacina da subunidade está sendo testada agora nos ensaios clínicos.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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