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Défis en cytométrie de flux élevée de complexité

Thought LeadersMª José MarcoDepartment of HematologyHospital Dr. Peset

La dernière décennie a vu une révolution dans l'immunothérapie du cancer.  La demande des médecins, des chercheurs, et des sociétés pharmaceutiques pour des résultats plus précis avec le contrôle de sensibilité et de haute qualité élevé augmente immensément.

Dans cette entrevue, DR. Mª José Marco du service de l'hématologie à M. Peset de Hopsital parle aux sciences de la vie Nouvelles-Médicales au sujet de la cytométrie de flux élevée de complexité et des défis qu'elles relèvent souvent.  

Veuillez donner une synthèse de cytométrie de flux élevée de complexité. Que contribue à sa complexité comparée à la cytométrie de flux inférieure de complexité ?

Beaucoup de gens confondent la cytométrie de flux élevée de complexité de condition (HCFC) avec l'augmentation simple du nombre de paramètres que nous pouvons mesurer sur un cytometer. Pour moi, ce concept est quelque chose beaucoup plus complexe. Quand nous nous référons à HCFC, nous parlons non seulement du nombre de couleurs, mais également de la qualité, de l'automatisation, des outils d'analyse, des réactifs, et du personnel.

Exécuter HCFC signifie l'amélioration dans chacun de ces aspects pour obtenir des résultats plus complets, plus précis, et plus de haute qualité ; et, dans mon cas, ceci affecte directement la qualité de vie de mes patients.

Pourquoi la cytométrie de flux élevée de complexité est-elle employée ? Quelles applications y a-t-il pour cette technique ?

Pendant la dernière décennie, nous avons remarqué une révolution dans l'immunothérapie du cancer. On a observé des améliorations significatif non seulement dans la désignation d'objectifs directe des antigènes extérieurs de tumeur par l'intermédiaire des anticorps monoclonaux neufs, comme Daratumumab ou Bispecific Engagers à cellule T (dégagements) comme Blinatumomab, mais également dans le domaine du traitement cellulaire adoptif (ACT) avec le développement des cellules de T chimériques de récepteur d'antigène (cellules de T de VÉHICULE) ou l'identification des molécules qui surmontent l'élimination immunisée inhibitrice produite par des cellules tumorales.

L'immunophénotypage par cytométrie de flux joue un central et un rôle très approprié dans plusieurs de ces traitements. En d'autres termes, la cytométrie de flux est non seulement employée pour le diagnostic et la catégorie du lymphome et de la leucémie, mais également pour le dépistage de la maladie résiduelle minimale (MRD) après demande de règlement, pour étudier la réaction immunitaire des patients, et même pour le contrôle de progrès de la demande de règlement lui-même, tel que surveiller le nombre de cellules de CHARIOT qui demeurent actives dans le patient après l'infusion.

En raison de tous ces raisons, médecins et résultats plus précis de demande de sociétés pharmaceutiques de sensibilité élevée et de contrôle plus de haute qualité.  Il isnecessary pour apporter des améliorations de chaque aspect de HCFC.

Crédit d'image : Shutterstock/lumière en cristal

Quel est dépistage résiduel minimal (MRD) de la maladie, et comment peut cytométrie de flux être employé dans son dépistage ?

La maladie résiduelle (mesurable) minimale (MRD) se rapporte à le petit nombre de cellules cancéreuses qui demeurent dans le fuselage après demande de règlement. Les mesures diagnostiques traditionnelles, telles que l'immunohistochimie et la morphologie, ont des sensibilités de dépistage seulement de 10-2 - 10-3, qui ne prévoient pas sûrement la survie progressive étape (PFS) ou la survie générale (OS) après ces demandes de règlement.

La capacité de recenser les cellules pathologiques peut fournir des données de valeur sur la réponse clinique et le risque de rechute. La négativité de millirutherford est chronique associée à la survie progressive étape et générale améliorée. Si convenablement validé et normalisé, elle pourrait être employée comme biomarqueur de remplacement de point final dans les tests cliniques évaluant des traitements nouveaux. Puis, il y a un intérêt clinique croissant pour la mesure et l'accomplissement de la négativité de millirutherford dans plusieurs maladies hématologiques, par exemple dans le myélome multiple, où les procédures de millirutherford sont actuel plus développées.

La surveillance de millirutherford de myélome multiple est actuel faite avec les plates-formes sensibles telles que l'amplification en chaîne par polymérase quantitative d'oligonucléotide d'allèle-détail (ASO-qPCR), l'ordonnancement de la deuxième génération (NGS), et la cytométrie de flux multiparametric (MFC). ASO-qPCR et NGS ont les excellentes sensibilités de dépistage (10-5 - 10)-6, mais ces technologies ont des possibilités d'application inférieures si comparés au cpc.

Le cpc conventionnel peut facilement atteindre une sensibilité de dépistage de 10-4, mais réaliser la sensibilité élevée exigée pour le bilan de millirutherford, des millions de cellules doivent être acquis et les protocoles conventionnels d'immunophénotypage ne peuvent pas réaliser ces numéros. Les directives actuelles d'accord exigent un minimum de 2 millions et recommandent 5 millions d'événements soient acquises pour atteindre une sensibilité minima de 10.-5

En d'autres termes, nous avons dû augmenter la spécificité et la sensibilité de la technique pour acquérir un numéro plus grand des événements et pour différencier la normale des cellules de plasma anormales.

Quels défis y a-t-il à adopter la cytométrie de flux élevée de complexité ?

À mon avis, ces défis peuvent être compris à trois étapes importantes. Nous devons nous concentrer sur l'amélioration de la souillure, de l'acquisition, et des procédés analytiques. Naturellement, à tous les niveaux, des éléments de la qualité accréditée doivent être introduits, qui dans mon cas doivent être admissibles pour le diagnostic clinique.

Si nous nous concentrons sur des procédures de échantillon-souillure, ce que nous pensons d'abord environ introduit des procédés d'automatisation pour réduire souiller des périodes et pour éliminer l'erreur humaine. Les Commissions d'immunophénotypage deviennent plus compliquées en adoptant HCFC, et ceci affecte directement le temps où un technicien passe sur traiter de réactif.

L'amélioration des opérations de saisie, peut-être, plus directement est liée au développement des cytometers performants de flux avec beaucoup de paramètres pour l'acquisition des Commissions complexes. Elles doivent également avoir une grande capacité pour le traitement de données, et, pour faciliter le contrôle qualité, elles doivent le rendre facile de surveiller le rendement, l'étalonnage, et les procédés de compensation et de standardisation entre les cytometers.

En conclusion, nous avons besoin du personnel qualifié, ainsi que du logiciel d'analyse qui nous permet d'effectuer des stratégies d'analyse complexes, et qui peut traiter un grand nombre d'événements et de paramètres.

Comment les photodiodes d'avalanche (APDs) peuvent-elles être utilisées au lieu des tubes photomultiplicateurs (PMTs) pour aider à simplifier la technologie utilisée ?

J'ai eu une expérience considérable utilisant des cytometers de CytoFLEX dans le laboratoire pour des projets de recherche d'intra-laboratoire en oncologie, pneumologie, et néphrologie. Ce cytometer comprend APDs (photodiodes d'avalanche) au lieu de PMTs (tubes photomultiplicateurs) comme détecteur de photons. Mon contrôle par retour de l'information au sujet d'APDs est positif.

D'abord, il a montré la linéarité grande entre les intensités mesurées (MFI) et les réglages de gain de détecteur. D'un point de vue pratique, le logiciel peut automatiquement recalculer des valeurs de débordement en temps réel pendant que les gains sont réglés. Ceci m'a permis d'employer la même expérience de compensation dans les Commissions avec différents réglages de gain. Ainsi, aucun temps extra n'est nécessaire pour faire un étalonnage de compensation par opposition aux cytometers traditionnels de flux utilisant des détecteurs de PMT.

Une autre caractéristique remarquable est sa sensibilité de fluorescence et bruit électronique inférieur. La sensibilité est la capacité de mesurer l'inférieur-intensité signe-dans d'autres mots, pour voir les populations obscures et intelligentes dans le même échantillon. En acquérant des nombres élevés des événements pour le millirutherford étudie, sensibilité est essentiel parce que les configurations d'expression d'antigène des populations normales abondantes peuvent superposer avec des configurations d'expression des populations rares de cellule anormale.

Ainsi, pour obtenir la discrimination la plus claire entre la normale et les cellules anormales, je recommande la cytométrie de flux élevée de complexité (HCFC), où des techniques de coloration novateurs et cytometer de flux de la technologie d'APD sont adoptés.

Crédit d'image : Photos de Shutterstock/CI

Comment le logiciel et la compensation aux paramètres particuliers de test peuvent-ils aider des chercheurs avec la cytométrie de flux élevée de complexité ?

Je suis convaincu que, pour la plupart des usagers de cytométrie de flux, n'importe quel outil qui facilite compensation automatique par logiciel intuitif et facile à utiliser est essentiel aujourd'hui. C'est particulièrement vrai en effectuant la cytométrie de flux élevée de complexité étudie, qui exigent un numéro plus grand des Commissions multicolores, où la combinaison de toute la fluorescence produit d'une grande modification de compensation.

Dans notre bilan de DxFLEX, nous avons réalisé que compensant 13 couleurs est très facile (nous avons habituellement travaillé avec entre 8 à 10 couleurs). Il est seulement nécessaire de souiller différents tubes pour que chaque fluorescence soit étudiée, de les acquérir utilisant le module automatique de compensation, et de régler le logiciel pour prévoir la modification de compensation. Cette modification de compensation peut être enrégistrée dans une bibliothèque de compensation qui peut être employée en combination avec les réglages de gain de catalogue pour produire n'importe quelle combinaison des réglages dans une Commission.

Ces caractéristiques sauvegardent beaucoup de temps dans la création des expériences, et dans le rendement de surveillance des cytometers, en plus de faciliter des flux de travail.

Comment est-ce que des réactifs de CE-IVD sont employés en cytométrie de flux élevée de complexité ? Pourquoi est-il important d'employer ces derniers, et quels défis supplémentaires portent-ils ?

Aujourd'hui, nous sommes sous la pression croissante de la gestion et des institutions de santé de gouvernement de se conformer à une suite de règlements et d'accréditations de contrôle qualité de laboratoire d'assurer la qualité et la fiabilité des résultats. Dans ce contexte, et sous les lieux même des adjudications publiques, l'inscription de CE-IVD est de plus en plus nécessaire pour le matériel, mais également pour des réactifs. Un de nos défis importants est, pour cette raison, d'augmenter le nombre de réactifs avec cette qualification, puisque, en plus de faciliter l'accréditation, ils réduisent à un minimum la validation interne et donnent des résultats fiables pour éviter la répétition des tests.

Par exemple, Ce-IVD-marqué des anticorps assurez les produits de qualité, la haute performance des fluorochromes tandem, et régularité de sort-à-sort, les caractéristiques de la plus haute importance dans HCFC expérimente. La conclusion du constructeur avec le plus grand catalogue de ces produits effectuera une différence.

Que peut être fait avec la préparation des échantillons pour simplifier la cytométrie de flux élevée de complexité ?

Pour simplifier la préparation des échantillons élevés de complexité, vous pouvez choisir d'automatiser le procédé ou les tubes predesigned par utilisation avec un cocktail des anticorps transformés en unités.

Dans notre laboratoire, nous avons une expérience considérable avec des tubes de DURAClone de coutre de Beckman dans des projets de recherche. Ces tubes contiennent une combinaison des anticorps monoclonaux pré dispensés et secs au bas du tube. Au moyen de eux a besoin de moins de temps à commande manuelle et réduit à un minimum introduire à la pipette des erreurs. Ces caractéristiques nous ont permises d'améliorer de manière significative nos flux de travail de laboratoire et coûts inférieurs dus à une réduction des erreurs.

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Queest-ce que la cytométrie de flux de coutre de Beckman offre d'aider des défis surmontés en cytométrie de flux élevée de complexité ?

Une de mes plus grandes préoccupations dans la routine quotidienne de notre laboratoire était la nécessité d'acquérir un numéro suffisamment grand des événements pour réaliser une sensibilité de 10-6 dans l'étude de millirutherford pour le myélome multiple.  Avec DxFLEX nous avons réalisé ceci, car nous avons pu acquérir jusqu'à 25 millions d'événements selon l'acquisition.

De plus, nous avons pu vérifier sa configuration maximum avec 13 Commissions de couleur qui fournissent une spécificité et une complexité plus grandes à l'analyse, tout en réduisant le nombre de tubes selon la Commission d'étude.

D'ailleurs, nous avons également amélioré des flux de travail dans l'échantillon traitant optimisant notre LDTs (tests développés par laboratoire) adoptant la technologie de DURAClone, et dans l'opération de saisie avec la compensation automatique, la standardisation, contrôle de la qualité quotidien, et surveillant des modules de rendement inclus en logiciel de DxFLEX.

Quand je suis devenu la première fois un usager de cytométrie de flux j'ai travaillé avec une autre compagnie commerciale. Quand j'ai commencé à travailler avec les sciences de la vie de coutre de Beckman, j'ai été agréablement étonné par leur connaissance technique, et également la qualité du support humain et scientifique derrière leurs produits, y compris la formation du personnel et une bonne volonté de nous aider à mettre en application des techniques neuves.

Quel est le contrat à terme de la cytométrie de flux élevée de complexité ?

Je crois que l'évolution naturelle de HCFC continuera à exiger des outils neufs d'améliorer la souillure, acquisition, et procédés analytiques. De cette façon, je suis heureux de voir que les sciences de la vie de coutre de Beckman développent les produits telles que lesquels fournissez les solutions pour chacune de ces remarques, par exemple, technologie de DURAClone pour améliorer souiller les procédés, et le matériel avancé tel que DxFLEX pour améliorer des opérations de saisie.

Cependant, je pense qu'un des défis importants sera quand traitant des caractéristiques, car bientôt nous serons plus capables d'augmenter le nombre d'échantillons traités et le nombre de paramètres analysés. Ceci nous déménagera graduellement vers l'analyse unicellulaire haut-dimensionnelle, qui présente ses propres défis en termes de gestion des données, visualisations de caractéristiques, reproductibilité de résultat, pouvoir de calcul, et partage des informations.

Dans ce sens, j'ai des grandes expectatives de coutre de Beckman en raison de leur acquisition du logiciel de Cytobank, qui active le nuage calculant pour l'analyse de cytométrie de flux. Le développement actuel des équipes par de Cytobank et de Kaluza logiciel est prometteur, et j'espère inclure ces outils neufs dans la future recherche.

Où peuvent les lecteurs trouver plus d'informations ?

Pour découvrir veuillez davantage pour visiter :

  • Critères internationaux d'accord de groupe de travail de myélome pour la réaction et l'évaluation résiduelle minimale de la maladie dans le myélome multiple. Kumar S, Paiva B, Anderson kc, Durie B, Landgren O, Moreau P, et autres bistouri Oncol. (2016) 17 : e328-46. doi : 10.1016/S1470- 2045(16) 30206-6
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  • La maladie résiduelle mesurable par la cytométrie de flux de la deuxième génération dans le myélome multiple. Paiva B, Puig N, la TA de Cedena, Rosiñol L, Cordón L, mb de Vidriales, et autres J 2020 Clin Oncol. 10 mars ; 38(8) : 784-792. doi : 10.1200/JCO.19.01231
  • Directives pratiques pour l'optimisation et la caractérisation de la plate-forme de CytoFlex TM de coutre de Beckman. Bhowmick D, Sheridan RTC, TP de Bushnell, Spalding kilolitre. Doi 2020 de la pièce A. de cytométrie : 10.1002/cyto.a.23998
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  • https://www.mybeckman.uk/flow-cytometry/instruments/dxflex?country=GB

Environ Mª José Marco

DR. Mª José Marco est un hématologue au service de l'hématologie, M. Peset d'hôpital, à Valence, l'Espagne. Après avoir complété son degré médical à l'université de Valence, l'Espagne, il a acquis une expérience considérable du diagnostic de cytométrie de flux concernant l'immunophénotypage de la leucémie et du lymphome.

Dans le laboratoire spécialisé d'hématologie, il a toujours eu la responsabilité de santé en cytométrie de flux, et il a été une partisane d'introduire les adaptations techniques qui sont possibles et nécessaires pour améliorer des soins aux patients. Sa recherche s'est concentrée sur clinique-biologique, les aspects résiduels diagnostiques et minimaux de la maladie avec la cytométrie-principal élevée de flux de complexité sur monoclonal gammopathie-et lui assiste le modèle et le développement des tests cliniques du statut immunitaire dans les patients présentant des greffes de cancer et d'organe.

Citations

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    Beckman Coulter Life Sciences - Flow Cytometry. (2020, September 25). Défis en cytométrie de flux élevée de complexité. News-Medical. Retrieved on November 26, 2020 from https://www.news-medical.net/news/20200924/Challenges-in-High-Complexity-Flow-Cytometry.aspx.

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  • Harvard

    Beckman Coulter Life Sciences - Flow Cytometry. 2020. Défis en cytométrie de flux élevée de complexité. News-Medical, viewed 26 November 2020, https://www.news-medical.net/news/20200924/Challenges-in-High-Complexity-Flow-Cytometry.aspx.