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Sfide in alta citometria a flusso di complessità

Thought LeadersMª José MarcoDepartment of HematologyHospital Dr. Peset

L'ultima decade ha veduto un giro di motore nell'immunoterapia del cancro.  La domanda da medici, dai ricercatori e dalle ditte farmaceutiche per i risultati più precisi con l'alta prova di alta qualità e del sensibilità sta aumentando immenso.

In questa intervista, DRA. Mª José Marco dal dipartimento dell'ematologia al Dott. Peset di Hopsital parla con scienze biologiche Notizia-Mediche circa alta citometria a flusso di complessità e le sfide che affrontano spesso.  

Faccia prego una generalità di alta citometria a flusso di complessità. Che cosa contribuisce alla sua complessità confrontata a citometria a flusso bassa di complessità?

Molta gente confonde l'alta citometria a flusso di complessità di termine (HCFC) con l'aumento semplice nel numero dei parametri che possiamo misurare su un cytometer. Per me, questo concetto è qualcosa molto più complesso. Quando ci riferiamo a HCFC, non solo stiamo parlando del numero dei colori, ma anche della qualità, dell'automazione, degli strumenti di analisi, dei reagenti e del personale.

L'esecuzione del HCFC significa migliorare in ciascuno di questi aspetti per ottenere i risultati più completi, più accurati e più di alta qualità; e, nel mio caso, questo direttamente pregiudica la qualità di vita dei miei pazienti.

Perché l'alta citometria a flusso di complessità è usata? Le che applicazioni sono ci per questa tecnica?

Nell'ultima decade, abbiamo avvertito un giro di motore nell'immunoterapia del cancro. Gli avanzamenti significativi sono stati osservati non solo nell'ottimizzazione diretta degli antigeni tumorali di superficie via i nuovi anticorpi monoclonali, come Daratumumab o Bispecific Engagers a cellula T (morsi) come Blinatumomab, ma anche nell'area della terapia cellulare adottiva (ACT) con lo sviluppo delle celle di T chimeriche del ricevitore dell'antigene (celle di T dell'AUTOMOBILE) o l'identificazione delle molecole che sormontano la soppressione immune inibitoria creata dalle celle del tumore.

Immunophenotyping da citometria a flusso svolge una centrale e un ruolo molto pertinente in molte di queste terapie. Cioè la citometria a flusso non solo è usata per la diagnosi e la classificazione di linfoma e della leucemia, ma anche per rilevazione della malattia residua minima (MRD) dopo il trattamento, per studiare la risposta immunitaria dei pazienti e perfino per controllo di progresso del trattamento stesso, come video del numero delle celle del CARRELLO che rimangono attive nel paziente dopo l'infusione.

dovuto tutti questi ragioni, medici e ditte farmaceutiche richieda i risultati più precisi dall'alta sensibilità e dalla prova più di alta qualità.  isnecessary apportare i miglioramenti in ogni aspetto di HCFC.

Credito di immagine: Shutterstock/indicatore luminoso di cristallo

Che cosa è rilevazione residua minima (MRD) di malattia e come può citometria a flusso essere utilizzato nella sua rilevazione?

La malattia residua (misurabile) minima (MRD) si riferisce al piccolo numero delle cellule tumorali che rimangono nell'organismo dopo il trattamento. Le misure diagnostiche tradizionali, quali il immunohistochemistry e la morfologia, hanno sensibilità di rilevazione di soltanto 10-2 - 10-3, che non predicono attendibilmente la sopravvivenza senza progressione (PFS) o la sopravvivenza globale (OS) dopo questi trattamenti.

La capacità di identificare le celle patologiche può fornire informazioni apprezzate sulla risposta e sul rischio clinici di ricaduta. La negatività di MRD è associata coerente con la sopravvivenza senza progressione e globale migliore. Se convalidato giustamente e standardizzato, potesse essere utilizzata come biomarcatore sostitutivo di punto finale nei test clinici che valutano le terapie innovarici. Poi, c'è un interesse clinico aumentante nella misura e nel risultato di negatività di MRD in parecchie malattie ematologiche, per esempio in mieloma multiplo, dove le procedure di MRD sono corrente diventate.

Il video di MRD di mieloma multiplo corrente è fatto con le piattaforme sensibili quali reazione a catena allele-specifica quantitativa della polimerasi dell'oligonucleotide (ASO-qPCR), l'ordinamento di prossima generazione (NGS) e la citometria a flusso multiparametric (MFC). Sia ASO-qPCR che NGS hanno sensibilità eccellenti di rilevazione (10-5 - 10)-6, ma queste tecnologie ha applicabilità più bassa una volta confrontati al MFC.

Il MFC convenzionale può raggiungere facilmente una sensibilità di rilevazione di 10-4, ma raggiungere l'alta sensibilità richiesta per la valutazione di MRD, milioni di celle devono acquistarsi ed i protocolli immunophenotyping convenzionali non possono raggiungere questi numeri. Le linee guida correnti di consenso richiedono un minimo di 2 milioni e raccomandano 5 milione eventi si acquistano per raggiungere una sensibilità minima di 10.-5

Cioè abbiamo dovuto aumentare la specificità e la sensibilità della tecnica per acquistare un maggior numero degli eventi e per differenziare il normale dalle celle di plasma anormali.

Che sfide sono ci ad adottare l'alta citometria a flusso di complessità?

A mio parere, quelle sfide possono essere incluse in tre fasi importanti. Dobbiamo mettere a fuoco sul miglioramento di macchiatura, di acquisizione e dei trattamenti analitici. Naturalmente, a tutti i livelli, gli elementi di qualità accreditata devono essere introdotti, che nel mio caso devono essere validi per la diagnosi clinica.

Se mettiamo a fuoco sulle procedure dimacchiatura, che cosa in primo luogo pensiamo circa sta introducendo i trattamenti di automazione per diminuire macchiare i periodi e per eliminare l'errore umano. I comitati di Immunophenotyping stanno diventando di più hanno complicato nell'adozione del HCFC e questo direttamente pregiudica il tempo che un tecnico passa sulla manipolazione del reagente.

Il miglioramento dei trattamenti di acquisizione, forse, più direttamente è collegato allo sviluppo dei cytometers ad alto rendimento di flusso con molti parametri per l'acquisizione dei comitati complessi. Devono anche avere una capacità elevata per trattamento dell'informazione e, facilitare il controllo di qualità, devono renderlo facile riflettere la prestazione, la calibratura ed i trattamenti della normalizzazione e della compensazione fra i cytometers.

Per concludere, abbiamo bisogno del personale qualificato come pure del software di analisi che permette che noi effettuiamo le strategie di analisi complesse e che può elaborare tantissimi eventi e parametri.

Come possono i fotodiodi della valanga (APDs) essere utilizzati invece dei tubi di fotomoltiplicatore (PMTs) per contribuire a semplificare la tecnologia usata?

Ho avuto estesa esperienza facendo uso dei cytometers di CytoFLEX nel laboratorio per i progetti di ricerca del intra-laboratorio in oncologia, pneumologia e nefrologia. Questo cytometer include APDs (fotodiodi della valanga) invece di PMTs (tubi di fotomoltiplicatore) come rivelatore del fotone. Il mio feedback circa APDs è positivo.

In primo luogo, ha indicato le grandi linearità fra le intensità misurate (MFI) e le impostazioni di guadagno del rivelatore. Da un punto di vista pratico, il software può ricalcolare automaticamente i valori dello straripamento in tempo reale poichè i guadagni sono regolato. Ciò ha permesso che me utilizzassi lo stesso esperimento della compensazione in comitati con differenti impostazioni di guadagno. Così, non ci sono tempi supplementari necessari effettuare una calibratura della compensazione rispetto ai cytometers tradizionali di flusso facendo uso dei rivelatori di PMT.

Un'altra funzionalità notevole è la sui sensibilità della fluorescenza e disturbo elettronico basso. La sensibilità è la capacità di misurare l'basso intensità segnale-in altre parole, per vedere le popolazioni tenui ed intelligenti nello stesso campione. Nell'acquistare i numeri alti degli eventi per il MRD studia, la sensibilità è cruciale perché i reticoli di espressione dell'antigene delle popolazioni normali abbondanti possono sovrapporrsi con i reticoli di espressione delle popolazioni anormali rare delle cellule.

Così, ottenere la più chiara distinzione fra le celle normali ed anormali, raccomando l'alta citometria a flusso di complessità (HCFC), dove le tecniche della coloritura innovarici e cytometer di flusso della tecnologia di APD sono adottate.

Credito di immagine: Foto di Shutterstock/CI

Come possono il software e la compensazione ai parametri particolari della prova aiutare i ricercatori con alta citometria a flusso di complessità?

Sono convinto che, per la maggior parte dei utenti di citometria a flusso, tutto lo strumento che facilita compensazione automatica attraverso software intuitivo e di facile impiego sia oggi essenziale. Ciò è particolarmente vera quando effettua l'alta citometria a flusso di complessità studia, che richiedono un maggior numero dei comitati colorati multi, in cui la combinazione di tutta la fluorescenza genera una grande matrice della compensazione.

Nella nostra valutazione di DxFLEX, abbiamo realizzato che compensando 13 colori è molto facile (abbiamo lavorato solitamente con in mezzo 8 - 10 colori). È necessario soltanto da macchiare i diversi tubi affinchè ogni fluorescenza sia studiato, da acquistarli facendo uso del modulo automatico della compensazione e da collocare il software per calcolare la matrice della compensazione. Questa matrice della compensazione può essere salvata in una libreria della compensazione che può essere usata congiuntamente alle impostazioni di guadagno del catalogo per creare tutta la combinazione di impostazioni in un comitato.

Queste funzionalità risparmiano molto tempo nella creazione degli esperimenti e nella prestazione di video dei cytometers, oltre a facilitare i flussi di lavoro.

Come i reagenti di CE-IVD sono utilizzati nell'alta citometria a flusso di complessità? Perché è importante usare questi e che sfide extra portano?

Oggi, siamo sotto pressione aumentante dall'amministrazione di governo e dalle istituzioni sanitarie aderire ad una serie di regolamenti e di accreditamenti di controllo di qualità del laboratorio per assicurare la qualità e l'affidabilità dei risultati. All'interno di questo contesto e nell'ambito dei locali anche delle gare pubbliche d'appalto, la marcatura di CE-IVD è necessaria sempre più per strumentazione, ma anche per i reagenti. Una delle nostre più grandi sfide, quindi, è di aumentare il numero dei reagenti con questa qualificazione, poiché, oltre a facilitare l'accreditamento, minimizzano la convalida interna e forniscono risultati affidabili per evitare la ripetizione delle prove.

Per esempio, Ce-IVD-contrassegnato anticorpi assicuri i prodotti di qualità, il rendimento elevato dei fluorocromi in tandem e consistenza del lotto--lotto, funzionalità importanti in HCFC sperimenta. L'individuazione del produttore con il più grande catalogo di questi prodotti farà una differenza.

Che cosa può essere fatto con il preparato del campione per semplificare l'alta citometria a flusso di complessità?

Per semplificare il preparato di alti campioni di complessità, potete scegliere di automatizzare il trattamento o i tubi predesigned uso con un cocktail degli anticorpi messi.

Nel nostro laboratorio, abbiamo estesa esperienza dei tubi di DURAClone del coltro di Beckman nei progetti di ricerca. Questi tubi contengono una combinazione di anticorpi monoclonali pre dispensati e secchi al fondo del tubo. Facendo uso di loro richiede meno tempo pratico e minimizza il prelevamento degli errori. Queste funzionalità ci hanno permesso di migliorare significativamente i nostri flussi di lavoro del laboratorio e bassi costi dovuto una riduzione degli errori.

Credito di immagine: Shutterstock/Kateryna Kon

Che cosa la citometria a flusso del coltro di Beckman offre aiutare le sfide sormontate in alta citometria a flusso di complessità?

Una delle mie più grandi preoccupazioni nella routine quotidiana del nostro laboratorio era la necessità di acquistare sufficientemente un grande numero degli eventi per raggiungere una sensibilità di 10-6 nello studio di MRD per il mieloma multiplo.  Con DxFLEX abbiamo raggiunto questo, poichè abbiamo potuti acquistare fino a 25 milione eventi per acquisizione.

Inoltre, abbiamo potuti verificare la sua configurazione massima con 13 comitati di colore che forniscono la maggiori specificità e complessità all'analisi, mentre diminuendo il numero dei tubi per comitato di studio.

Inoltre, egualmente abbiamo migliorato i flussi di lavoro nel trattamento del campione che ottimizza il nostro LDTs (prove sviluppate laboratorio) che adottiamo la tecnologia di DURAClone e nel trattamento di acquisizione con la compensazione automatica, la normalizzazione, il controllo di qualità quotidiano e riflettenti i moduli della prestazione inclusi nel software di DxFLEX.

Quando in primo luogo sono diventato un utente di citometria a flusso ho lavorato con un'altra società commerciale. Quando ho cominciato lavorare con le scienze biologiche del coltro di Beckman, sono stato sorpreso piacevolmente dalla loro conoscenza tecnologica ed anche dalla qualità del supporto umano e scientifico dietro i loro prodotti, compreso formazione del personale e una volontà aiutarci ad applicare le nuove tecniche.

Che cosa è il futuro di alta citometria a flusso di complessità?

Credo che l'evoluzione naturale di HCFC continui a richiedere i nuovi strumenti di migliorare la macchiatura, acquisizione e trattamenti analitici. In questo modo, sono felice di vedere che le scienze biologiche del coltro di Beckman stanno sviluppando i prodotti cui fornisca le soluzioni per ciascuno di questi punti, come, per esempio, la tecnologia di DURAClone per migliorare la macchiatura i trattamenti e delle attrezzature avanzate quale DxFLEX per migliorare i trattamenti di acquisizione.

Tuttavia, penso che una di più grandi sfide sia quando elabori i dati, poichè presto saremo più capaci di aumento il numero dei campioni elaborati e del numero dei parametri analizzati. Ciò ci avanzerà gradualmente verso l'analisi unicellulare alto-dimensionale, che presenta le sue proprie sfide in termini di gestione di dati, visualizzazioni di dati, riproducibilità di risultato, potenza di calcolo e condivisione delle informazioni.

In questo senso, ho grandi speranze del coltro di Beckman come conseguenza della loro acquisizione del software di Cytobank, che permette alla nuvola che computa per l'analisi di citometria a flusso. Lo sviluppo in corso gruppi dal software di Kaluza e di Cytobank sta promettendo e spero di includere questi nuovi strumenti nella ricerca futura.

Dove possono i lettori trovare più informazioni?

Per scoprire di più vogliate per visualizzare:

  • Criteri internazionali di consenso del gruppo di lavoro di mieloma per la risposta e la valutazione residua minima di malattia in mieloma multiplo. Kumar S, Paiva B, Anderson KC, Durie B, Landgren O, Moreau P, et al. lancetta Oncol. (2016) 17: e328-46. doi: 10.1016/S1470- 2045(16) 30206-6
  • Linee guida di consenso su analisi residua minima e sulla segnalazione di malattia di mieloma delle cellule di plasma. Arroz m., è venuto N, Lin P, Chen W, yuan C, Lagoo A, et al. Cytometry B Clin Cytom. (2016) 90:31 -. doi 9: 10.1002/cyto.b.21228
  • Flusso di Next Generation per rilevazione altamente sensibile e standardizzata della malattia residua minima in mieloma multiplo. Flores-Montero J, Sanoja-Flores L, Paiva B, Puig N, Garcia-Sanchez O, leucemia 2017 di Böttcher S et al. ottobre; 31(10): 2094-2103. doi: 10.1038/leu.2017.29
  • Malattia residua misurabile da citometria a flusso di prossima generazione in mieloma multiplo. Paiva B, Puig N, la TA di Cedena, Rosiñol L, Cordón L, MB di Vidriales, et al. J 2020 Clin Oncol. 10 marzo; 38(8): 784-792. doi: 10.1200/JCO.19.01231
  • Linee guida pratiche per ottimizzazione e la caratterizzazione della piattaforma di CytoFlex TM del coltro di Beckman. Bhowmick D, Sheridan RTC, Bushnell TP, Spalding chilolitro. Doi 2020 della parte A. di Cytometry: 10.1002/cyto.a.23998
  • Ad un cytometer Basato a semiconduttore novello di flusso con la sensibilità luminosa migliorata dello spargimento per l'analisi delle nanoparticelle biologiche. GASCROMATOGRAFIA di Brittain, Chen YQ, Nartinez E, Tang VA, Tylre m. R, Langlois mA, Gulnik. Sci rappresentante 2019 5 novembre; 9(1): . doi 16039: 10.1038/s41598-019-52366-4
  • https://www.mybeckman.uk/flow-cytometry/instruments/dxflex?country=GB

Circa Mª José Marco

DRA. Mª José Marco è un ematologo al dipartimento dell'ematologia, il Dott. Peset dell'ospedale, a Valencia, la Spagna. Dopo il completamento della sua laurea medica all'università di Valencia, la Spagna, ha acquisito l'estesa esperienza di diagnosi di citometria a flusso che comprende immunophenotyping della leucemia e del linfoma.

Nel laboratorio specializzato dell'ematologia, ha avuta sempre responsabilità di sanità in citometria a flusso ed è stata un fautore di introdurre gli adattamenti tecnologici che sono necessari possibili e per migliorare la cura paziente. La sua ricerca ha messo a fuoco su clinico-biologico, gli aspetti residui diagnostici e minimi di malattia con l'alto cytometry-principale di flusso di complessità su monoclonale gammopatia-e sulla lei assiste a progettazione ed allo sviluppo dei test clinici di stato immune in pazienti con cancro e trapianti di organi.

Citations

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    Beckman Coulter Life Sciences - Flow Cytometry. (2020, September 25). Sfide in alta citometria a flusso di complessità. News-Medical. Retrieved on November 26, 2020 from https://www.news-medical.net/news/20200924/Challenges-in-High-Complexity-Flow-Cytometry.aspx.

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    Beckman Coulter Life Sciences - Flow Cytometry. "Sfide in alta citometria a flusso di complessità". News-Medical. https://www.news-medical.net/news/20200924/Challenges-in-High-Complexity-Flow-Cytometry.aspx. (accessed November 26, 2020).

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    Beckman Coulter Life Sciences - Flow Cytometry. 2020. Sfide in alta citometria a flusso di complessità. News-Medical, viewed 26 November 2020, https://www.news-medical.net/news/20200924/Challenges-in-High-Complexity-Flow-Cytometry.aspx.