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Desafios no Cytometry de fluxo alto da complexidade

Thought LeadersMª José MarcoDepartment of HematologyHospital Dr. Peset

A última década considerou uma revolução na imunoterapia do cancro.  A procura dos doutores, dos pesquisadores, e das companhias farmacéuticas para uns resultados mais precisos com o teste alto do sensibilidade e o de alta qualidade está aumentando imensa.

Nesta entrevista, Dracmas. Mª José Marco do departamento da hematologia no Dr. Peset de Hopsital fala às ciências da vida Notícia-Médicas sobre o cytometry de fluxo alto da complexidade e os desafios que enfrentam frequentemente.  

Dê por favor uma vista geral do cytometry de fluxo alto da complexidade. Que contribui a sua complexidade comparada ao baixo cytometry de fluxo da complexidade?

Muitos povos confundem o cytometry de fluxo alto da complexidade do termo (HCFC) com o aumento simples no número de parâmetros que nós podemos medir em um cytometer. Para mim, este conceito é algo muito mais complexo. Quando nós referimos HCFC, nós estamos falando não somente sobre o número de cores, mas igualmente a qualidade, a automatização, as ferramentas de análise, os reagentes, e o pessoal.

Executar HCFC significa o melhoramento em cada um destes aspectos para obter uns resultados mais completos, mais exactos, e mais de alta qualidade; e, em meu caso, isto afecta directamente a qualidade de vida de meus pacientes.

Por que o cytometry de fluxo alto da complexidade é usado? Que aplicações há para esta técnica?

Na última década, nós experimentamos uma revolução na imunoterapia do cancro. Os avanços significativos foram observados não somente na escolha de objectivos directa dos antígenos de superfície do tumor através dos anticorpos monoclonais novos, como Daratumumab ou Bispecific Engagers de célula T (mordidas) como Blinatumomab, mas igualmente na área da terapia celular adoptiva (ACT) com a revelação de pilhas de T quiméricoas do receptor do antígeno (pilhas de T do CARRO) ou a identificação das moléculas que superam a supressão imune inibitório criada por pilhas do tumor.

Immunophenotyping pelo cytometry de fluxo joga uma central e um papel muito relevante em muitas destas terapias. Ou seja o cytometry de fluxo é usado não somente para o diagnóstico e a classificação do linfoma e da leucemia, mas igualmente para a detecção de doença residual mínima (MRD) após o tratamento, para estudar a resposta imune dos pacientes, e mesmo para o controle de progresso do tratamento próprio, tal como a monitoração do número de pilhas do CARRO que permanecem activas no paciente após a infusão.

Devido a todos estes razões, doutores e resultados mais precisos da procura de companhias farmacéuticas da sensibilidade alta e do teste mais de alta qualidade.  Ele isnecessary para fazer melhorias em cada aspecto de HCFC.

Crédito de imagem: Shutterstock/luz de cristal

Que são detecção residual mínima (MRD) da doença, e como podem cytometry de fluxo ser usados em sua detecção?

A doença residual (mensurável) mínima (MRD) refere o número pequeno de células cancerosas que permanecem no corpo após o tratamento. As medidas diagnósticas tradicionais, tais como o immunohistochemistry e a morfologia, têm as sensibilidades da detecção de somente 10-2 - 10-3, que não prevêem confiantemente a sobrevivência progressão-livre (PFS) ou a sobrevivência total (OS) após estes tratamentos.

A capacidade para identificar pilhas patológicas pode fornecer a informação valiosa na resposta clínica e o risco de tem uma recaída. A negatividade do MRD é associada consistentemente com a sobrevivência progressão-livre e total melhorada. Se validado apropriadamente e estandardizado, poderia ser usada como um biomarker substituto do valor-limite nos ensaios clínicos que avaliam terapias novas. Então, há um interesse clínico crescente na medida e na realização da negatividade do MRD em diversas doenças hematológicas, por exemplo no mieloma múltiplo, onde os procedimentos do MRD são actualmente mais tornados.

A monitoração do MRD do mieloma múltiplo é feita actualmente com plataformas sensíveis tais como a reacção em cadeia alelo-específica quantitativa da polimerase do oligonucleotide (ASO-qPCR), a próxima geração que arranjam em seqüência (NGS), e o cytometry de fluxo multiparametric (MFC). ASO-qPCR e NGS têm as sensibilidades excelentes da detecção (10-5 - 10-6), mas estas tecnologias têm uma mais baixa aplicabilidade quando comparadas ao MFC.

O MFC convencional pode facilmente alcançar uma sensibilidade da detecção de 10-4, mas conseguir a sensibilidade alta exigida para a avaliação do MRD, milhões de pilhas têm que ser adquiridos e os protocolos immunophenotyping convencionais são incapazes de conseguir estes números. As directrizes actuais do consenso exigem um mínimo de 2 milhões e recomendam 5 milhão eventos sejam adquiridas para alcançar uma sensibilidade mínima de 10.-5

Ou seja nós tivemos que aumentar a especificidade e a sensibilidade da técnica para adquirir um número maior de eventos e para diferenciar o normal das pilhas de plasma anormais.

Que desafios há a adotar o cytometry de fluxo alto da complexidade?

Na minha opinião, aqueles desafios podem ser incluídos em três fases principais. Nós devemos centrar-se sobre a melhoria da mancha, da aquisição, e de processos analíticos. Naturalmente, a todos os níveis, os elementos da qualidade acreditada devem ser introduzidos, que em meu caso devem ser válidos para o diagnóstico clínico.

Se nós nos centramos sobre procedimentos demancha, o que nós pensamos primeiramente aproximadamente está introduzindo processos da automatização para reduzir-se manchar épocas e para eliminar a falha humana. Os painéis de Immunophenotyping estão tornando-se complicaram mais em adotar HCFC, e este afecta directamente o tempo onde um técnico passa na manipulação do reagente.

A melhoria de processos de aquisição, talvez, é ligada mais directamente à revelação de cytometers de capacidade elevada do fluxo com muitos parâmetros para a aquisição dos painéis complexos. Devem igualmente ter uma capacidade alta para o processo de dados, e, para facilitar o controle da qualidade, devem fazê-lo fácil monitorar o desempenho, a calibração, e os processos da compensação e da normalização entre cytometers.

Finalmente, nós precisamos o pessoal qualificado, assim como o software de análise que permitem que nós realizem estratégias de análise complexas, e que pode processar um grande número eventos e parâmetros.

Como podem os fotodiodos da avalancha (APDs) ser usados no lugar das câmaras de ar de photomultiplier (PMTs) para ajudar a simplificar a tecnologia usada?

Eu tive a experiência extensiva usando cytometers de CytoFLEX no laboratório para projectos de investigação do intra-laboratório na oncologia, na pneumologia, e na nefrologia. Este cytometer inclui APDs (fotodiodos da avalancha) em vez de PMTs (câmaras de ar de Photomultiplier) como um detector do fotão. Meu feedback sobre APDs é positivo.

Primeiramente, mostrou grandes linearidades entre as intensidades medidas (MFI) e os ajustes do ganho do detector. De um ponto de vista prático, o software pode automaticamente voltar a calcular valores da difusão no tempo real enquanto os ganhos são ajustados. Isto permitiu que eu use a mesma experiência da compensação nos painéis com ajustes diferentes do ganho. Assim, nenhum tempo adicional é necessário fazer uma calibração da compensação ao contrário dos cytometers tradicionais do fluxo usando detectores de PMT.

Uma outra característica notável é seus sensibilidade da fluorescência e baixo ruído eletrônico. A sensibilidade é a capacidade medir a baixo-intensidade sinal-em outras palavras, para considerar populações não ofuscantes e brilhantes na mesma amostra. Ao adquirir números altos de eventos para o MRD estuda, sensibilidade é crucial porque os testes padrões da expressão do antígeno de populações normais abundantes podem sobrepr com os testes padrões da expressão de populações anormais raras da pilha.

Assim, para obter a discriminação a mais clara entre pilhas normais e anormais, eu recomendo o cytometry de fluxo alto da complexidade (HCFC), onde as técnicas de mancha inovativas e da tecnologia de APD cytometer do fluxo são adotadas.

Crédito de imagem: Fotos de Shutterstock/CI

Como podem o software e a compensação aos parâmetros particulares do teste ajudar pesquisadores com cytometry de fluxo alto da complexidade?

Eu sou convencido que, para a maioria de usuários do cytometry de fluxo, toda a ferramenta que facilitar compensação automática através do software intuitivo e fácil de usar é essencial hoje. Isto é especialmente verdadeiro ao realizar o cytometry de fluxo alto da complexidade estuda, que exigem um número maior de painéis multi-coloridos, onde a combinação de toda a fluorescência gera uma grande matriz da compensação.

Em nossa avaliação de DxFLEX, nós realizamos que compensando 13 cores é muito fácil (nós trabalhamos geralmente com no meio 8 a 10 cores). É somente necessário manchar as câmaras de ar individuais para que cada fluorescência seja estudada, adquiri-las que usam o módulo automático da compensação, e ajustar o software para calcular a matriz da compensação. Esta matriz da compensação pode ser salvar em uma biblioteca da compensação que possa ser usada em combinação com os ajustes do ganho do catálogo para criar toda a combinação de ajustes em um painel.

Estas características salvar muito tempo na criação das experiências, e no desempenho da monitoração dos cytometers, além do que a facilitação de trabalhos.

Como os reagentes de CE-IVD são usados no cytometry de fluxo alto da complexidade? Por que é importante usar estes, e que desafios extra trazem?

Hoje, nós estamos sob a pressão crescente da administração do governo e as instituições de saúde a seguir com uma série de qualidade do laboratório controlam regulamentos e abonações para assegurar a qualidade e a confiança dos resultados. Dentro deste contexto, e sob os locais mesmo de propostas públicas, a marcação de CE-IVD é cada vez mais necessária para o equipamento, mas igualmente para reagentes. Um de nossos desafios mais grandes, é conseqüentemente aumentar o número de reagentes com esta qualificação, desde que, além do que a facilitação da abonação, minimizam a validação interna e dão resultados seguros para evitar a repetição dos testes.

Por exemplo, CE-IVD-etiquetado anticorpos assegure produtos de qualidade, o elevado desempenho de fluorochromes em tandem, e consistência do lote-à-lote, características da mais alta importância em HCFC experimenta. Encontrar o fabricante com o catálogo o maior destes produtos fará uma diferença.

Que pode ser feito com preparação da amostra para simplificar o cytometry de fluxo alto da complexidade?

Para simplificar a preparação de amostras altas da complexidade, você pode escolher automatizar o processo ou as câmaras de ar predesigned uso com um cocktail de anticorpos transformados.

Em nosso laboratório, nós temos a experiência extensiva com as câmaras de ar de DURAClone da relha de Beckman nos projectos de investigação. Estas câmaras de ar contêm uma combinação de anticorpos monoclonais pre dispensados e secados na parte inferior da câmara de ar. Usá-los exige menos tempo a trabalhar e minimiza introduzir com pipeta erros. Estas características permitiram-nos de melhorar significativamente nossos trabalhos do laboratório e mais baixos custos devido a uma redução nos erros.

Crédito de imagem: Shutterstock/Kateryna Kon

Que o Cytometry de fluxo da relha de Beckman oferece ajudar desafios superados no cytometry de fluxo alto da complexidade?

Um de meus interesses mais grandes na rotina diária de nosso laboratório era a necessidade de adquirir um número suficientemente grande de eventos para conseguir uma sensibilidade de 10-6 no estudo do MRD para o mieloma múltiplo.  Com DxFLEX nós conseguimos este, porque nós pudemos adquirir até 25 milhão eventos pela aquisição.

Além, nós pudemos testar sua configuração máxima com os 13 painéis da cor que fornecem a maiores especificidade e complexidade à análise, ao reduzir o número de câmaras de ar pelo painel do estudo.

Além disso, nós igualmente melhoramos trabalhos na amostra que processa aperfeiçoando nosso LDTs (testes desenvolvidos laboratório) que adotamos a tecnologia de DURAClone, e no processo de aquisição com a compensação automática, a normalização, QC diário, e monitorando os módulos do desempenho incluídos no software de DxFLEX.

Quando eu me transformei primeiramente um usuário do cytometry de fluxo eu trabalhei com uma outra empresa comercial. Quando eu comecei trabalhar com ciências da vida da relha de Beckman, eu fui surpreendido agradavelmente por seu conhecimento tecnologico, e igualmente pela qualidade do apoio humano e científico atrás de seus produtos, incluindo a formação do pessoal e uma vontade ajudar-nos a executar técnicas novas.

Que é o futuro do cytometry de fluxo alto da complexidade?

Eu acredito que a evolução natural de HCFC continuará a exigir novas ferramentas melhorar a mancha, aquisição, e processos analíticos. Desta maneira, eu estou feliz ver que as ciências da vida da relha de Beckman estão desenvolvendo os produtos que forneça soluções para cada um destes pontos, tais como, por exemplo, tecnologia de DURAClone para melhorar a mancha de processos, e de equipamento avançado tal como DxFLEX para melhorar processos de aquisição.

Contudo, eu penso que um dos desafios os mais grandes será ao processar dados, porque logo nós seremos mais capazes de aumentar o número de amostras processadas e o número de parâmetros analisados. Isto mover-nos-á gradualmente para a análise alto-dimensional da único-pilha, que apresenta seus próprios desafios em termos da gestão de dados, dos visualizações dos dados, da reprodutibilidade do resultado, da potência computacional, e da partilha de informação.

Neste sentido, eu tenho grandes expectativas da relha de Beckman em conseqüência de sua aquisição do software de Cytobank, que permite a nuvem que computa para a análise do cytometry de fluxo. A revelação em curso equipes pelo software de Cytobank e de Kaluza é prometedora, e eu espero incluir estas novas ferramentas na pesquisa futura.

Onde podem os leitores encontrar mais informação?

Para encontrar satisfaça mais para visitar:

  • Critérios internacionais do consenso do grupo de trabalho do mieloma para a resposta e a avaliação residual mínima da doença no mieloma múltiplo. Kumar S, Paiva B, Anderson KC, Durie B, Landgren O, Moreau P, e outros lanceta Oncol. (2016) 17: e328-46. doi: 10.1016/S1470- 2045(16) 30206-6
  • Directrizes do consenso na análise residual mínima e no relatório da doença do mieloma da pilha de plasma. Arroz M, veio N, Lin P, Chen W, Yuan C, Lagoo A, e outros Cytometry B Clin Cytom. (2016) 90:31 -. doi 9: 10.1002/cyto.b.21228
  • Fluxo da próxima geração para a detecção altamente sensível e estandardizada de doença residual mínima no mieloma múltiplo. Flores-Montero J, Sanoja-Flores L, Paiva B, Puig N, García-Sánchez O, leucemia 2017 de Böttcher S e outros outubro; 31(10): 2094-2103. doi: 10.1038/leu.2017.29
  • Doença residual mensurável pelo cytometry de fluxo da próxima geração no mieloma múltiplo. Paiva B, Puig N, TA de Cedena, Rosiñol L, Cordón L, MB de Vidriales, e outros J 2020 Clin Oncol. 10 de março; 38(8): 784-792. doi: 10.1200/JCO.19.01231
  • Directrizes práticas para a optimização e a caracterização da plataforma de CytoFlex TM da relha de Beckman. Bhowmick D, Sheridan RTC, Bushnell TP, Spalding quilolitro. Doi 2020 da peça A. do Cytometry: 10.1002/cyto.a.23998
  • Um cytometer Semicondutor-Baseado novela do fluxo com sensibilidade aumentada do Scatter da Luz para a análise de nanoparticles biológicos. GC de Brittain, Chen YQ, Nartinez E, Tang VA, Tylre M R, Langlois miliampère, Gulnik. Sci representante 2019 o 5 de novembro; 9(1): . doi 16039: 10.1038/s41598-019-52366-4
  • https://www.mybeckman.uk/flow-cytometry/instruments/dxflex?country=GB

Aproximadamente Mª José Marco

Dracmas. Mª José Marco é um hematologist no departamento da hematologia, Dr. Peset do hospital, em Valência, Espanha. Após ter terminado seu grau médico na universidade de Valência, Espanha, ganhou a experiência extensiva no diagnóstico do cytometry de fluxo que envolve immunophenotyping da leucemia e do linfoma.

No laboratório especializado da hematologia, teve sempre a responsabilidade dos cuidados médicos no cytometry de fluxo, e foi um proponente de introduzir as adaptações tecnologicos que são possíveis e necessárias para melhorar o assistência ao paciente. Sua pesquisa focalizou em clínico-biológico, os aspectos residuais diagnósticos e mínimos da doença com cytometry-principal alto do fluxo da complexidade em monoclonal gammopathies-e na ela ajudam com projecto e revelação dos ensaios clínicos de estado imune nos pacientes com transplantações do cancro e de órgão.

Citations

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    Beckman Coulter Life Sciences - Flow Cytometry. (2020, September 25). Desafios no Cytometry de fluxo alto da complexidade. News-Medical. Retrieved on November 25, 2020 from https://www.news-medical.net/news/20200924/Challenges-in-High-Complexity-Flow-Cytometry.aspx.

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    Beckman Coulter Life Sciences - Flow Cytometry. "Desafios no Cytometry de fluxo alto da complexidade". News-Medical. 25 November 2020. <https://www.news-medical.net/news/20200924/Challenges-in-High-Complexity-Flow-Cytometry.aspx>.

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    Beckman Coulter Life Sciences - Flow Cytometry. "Desafios no Cytometry de fluxo alto da complexidade". News-Medical. https://www.news-medical.net/news/20200924/Challenges-in-High-Complexity-Flow-Cytometry.aspx. (accessed November 25, 2020).

  • Harvard

    Beckman Coulter Life Sciences - Flow Cytometry. 2020. Desafios no Cytometry de fluxo alto da complexidade. News-Medical, viewed 25 November 2020, https://www.news-medical.net/news/20200924/Challenges-in-High-Complexity-Flow-Cytometry.aspx.